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文章来源：中华检验医学杂志,2019,42(7): 498-502 作者：刘雪丽 常椿欣 徐晨明
目前临床上男性不育患者的诊治手段有限，随着辅助生殖技术的不断发展，对精度更高的技术的需求日益迫切。拉曼光谱技术是一种高灵敏度的、样品无标记无损的快速分析技术，可以检测到分子层面的异常，是评估男性生育力和协助辅助生殖治疗的重要方法。本文综述了拉曼光谱技术的基本原理、主要分类及其在精液分析等男性生殖领域中的研究近况。
随着环境污染、生活方式和饮食结构等因素的变化，男方因素在不孕夫妇中所占比例越来越高，因此辅助生殖治疗中全面评估男性生育力并挑选正常的精子至关重要。但是，目前临床上的精液分析参数不足以全面诊断男性不育。同时，由于对精子内部研究的方法学会破坏精子本身导致其不能用于后续受精，大多临床实验室实施卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）时对精子的分析仅限于形态学和运动学分析。拉曼光谱技术由于其快速、高灵敏度、对样本无创、与样本非接触无标记等特点，在男性不育治疗中显示出巨大的潜力。
1928年，印度物理学家C.V Raman发现了光的非弹性散射现象，也就是拉曼效应。用单色激光照射样品，大部分光子能量不变，发生弹性散射，又称瑞利散射；极少的光子与样品分子内的化学键相互作用，获得或损失能量，产生比激发波长短（反斯托克）或长（斯托克）的非弹性散射，即拉曼散射（Raman scattering）。拉曼光谱利用散射光通过对分子振动的信息解析单个化合物的结构、对称性、电子环境以及分子的键合，完成定性和定量分析[1]。拉曼光谱因其在亚细胞水平下可获得高质量光谱，以及无创、无标记和不受水信号干扰等优势，克服了当前许多技术的局限性，成为生物体内研究的理想方法[2]。
（一）表面增强拉曼光谱（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）自发产生的拉曼散射效率极低，约108个光子中仅一个产生非弹性散射。1974年Fleischmann等[3]发现在银电极吸附的吡啶的拉曼信号明显增强，观察到了SERS效应。随着纳米技术的快速发展，SERS获得了许多突破性的进展。用拉曼光谱法检测吸附在粗糙化的纳米尺度的金属表面或金属胶状悬浮液（以金、银和铜为主）的样品，表面等离子体共振引起的物理电磁增强以及吸附的分子内电荷转移引起的化学增强可使拉曼散射强度提高104~106倍。SERS优势在于将检测灵敏度提高至单分子水平，在生物分析方面有独特优势。与荧光相比，SERS耐光漂白和光降解，可以进行长期监测；可根据检测目的优化活性纳米结构的尺寸、形状和材料，用于不同的检测目的；尤其是SERS基底可进行优化加工，在近红外光作为光源时避免生物样本的自发荧光，减少可见激光对活细胞的光损伤[4]。SERS的优势使其在分析科学、表面科学、材料科学、化学和生物医学研究等领域中有了广泛应用。
（二）共聚焦显微拉曼光谱（confocal Raman microspectroscopy，CRM）CRM是将拉曼光谱与共聚焦显微系统相结合的高分辨率成像技术。1990年Pupples等[5]研发了CRM，其高空间分辨率可以更好地研究单细胞和染色体。CRM利用激光光束通过显微镜聚集成一个微米级光斑，移动光斑可实现逐点扫描，精确获得样品的分子及其空间分布的信息，显著提高了横向和纵向空间分辨率，可达到单细胞至亚细胞水平，是研究不同生物组织和活细胞的有力工具。研究人员等研发了定量体积拉曼成像技术，并用该技术对人诱导多能干细胞和衍生心肌细胞进行了无标记3D成像，展示了细胞形状、细胞质、细胞核、脂质体和细胞骨架结构的三维精细细节的可视化和量化[6]。
（三）激光共振拉曼光谱（resonance Raman spectroscopy，RRS）RRS通过调节入射激光波长使其能量与目的分子的电子激发跃迁的能量相近，两者产生共振时拉曼散射可增强106倍，并能掩盖其他过渡信号。在RRS中，入射光的波长落在发色团的吸收带内，激发能和吸收能的重叠大大提高了吸收物质的拉曼散射效率；RRS探测特定发色团振动光谱的能力使其成为研究复杂混合物中生物分子结构的一种高敏感性高选择性的实用技术[7]。Kast等[8]的研究指出RRS适合一次性观察相对较少的振动模式，降低了光谱的复杂性，更容易识别未知蛋白；当使用532 nm的激发光时，细胞色素C会显示强散射，形成细胞线粒体的特殊成像。因此，RRS是研究有机系统特定复合成分强有力的实验室工具。
（四）近红外傅立叶变换拉曼光谱（near infrared Fourier-transform Raman spectroscopy，NIR-FT-RS）NIR-FT-RS采用波长为1 064 nm的近红外光源作为激发光源，光子能量低，难以激发电子跃迁，因此有效减少了荧光信号干扰。此外，与传统的激光拉曼光谱相比，傅立叶变换的干涉仪型光谱仪具有检测速度快、热效应小、辐射通量大、波数测量精密度高、在光导纤维中传递性能好等优点。Dzsaber等[9]的研究表明，NIR-FT-RS具有光谱精度、高通量、高灵敏度、小体积和经济适用等优点。
精液由精子和精浆组成，其中精浆是受精过程中起保护和滋养精子作用的非细胞成分，比例高达95%。精浆内相关生化标志物不仅反映附属性腺的功能，还能预测精子质量，因此精浆生化分析对评估男性生育力非常重要。目前，我国临床实验室开展精浆生化检测的主要检测指标为α-葡糖苷酶、锌、果糖和酸性磷酸酶。尽管精浆生化检测技术已经十分成熟，但存在检测步骤繁琐和费时缺点，而拉曼光谱技术的应用不仅可以帮助实验室简化步骤节省时间，还能检测到普通精液生化检测范围以外的异常。精液的拉曼光谱主特征峰包括酪氨酸、氨基化合物Ⅰ和Ⅲ以及磷酸精胺六水[10]。Chen等[11]用偏振SERS区分了正常和异常精浆样本，并评估了非偏振、线偏振和圆偏振光在精浆诊断方面的性能（敏感度95.8%，特异度64.9%），证明精浆的拉曼光谱可反映其生物分子成分。Huang等[12]确定了精浆柠檬酸的特征拉曼峰为942 cm-1，可定量检测精液中柠檬酸含量。KambizGilany团队用拉曼光谱技术对少弱精患者、特发性男性不育患者和非梗阻性无精子症（non-obstructive azoospermia，NOA）患者的精浆代谢物进行了研究，发现特发性男性不育患者精浆的氧化应激标志物-CH的谱峰（2 800~3 000 cm-1）显著升高、功能性抗氧化物-SH的谱峰（2 550~2 600 cm-1）显著降低；拉曼光谱对NOA患者精浆代谢指纹分析评估发现，经睾丸精子提取术（testicular sperm extraction，TESE）未获精子组的患者比TESE后获得精子组患者的精浆氧化失衡程度更高，说明基于拉曼光谱技术的代谢指纹分析有望成为评估NOA症患者生精功能的简便方法[13,14,15]。
目前临床实验室实施ICSI时多依据形态和活动力进行精子的选择，但精子形态的判断通常因技术人员的主观判断而异，而且精子形态也不能完全反映内在分子情况[16,17,18,19]。近年的研究表明，精子核DNA（nuclear DNA，nDNA）完整性不仅会严重影响到精子的受精能力，受精后原核的形成，而且可影响胚胎着床发育，精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）的升高可引起胚胎发育不良和早期流产。因此，精子nDNA完整性是判读精子质量的另一个有效依据。染色质结构分析法（sperm chromatin structure assay，SCSA）、彗星实验（COMET assay）、精子染色质扩散实验（sperm chromatin dispersion test，SCD）和TUNEL法是目前主要检测nDNA的方法，但这些方法需要变性、裂解或染色等步骤，受检精子被破坏，不能用于后续受精。拉曼光谱技术可以无创地测量精子的DNA损伤情况，提供精确和准确的特定精子DNA质量信息，同时保持其细胞完整性和生育力，允许检测后精子用于ICSI。此外，通过检测拉曼光谱中的特征性条带，可以在精子样品中揭示实验诱导的精子DNA损伤，并对损伤部位和损伤程度进行准确的评估。Mallidis等[20]用拉曼显微光谱结合主成分分析研究精子nDNA紫外损伤模型，观察到PO4骨架主峰向1 042 cm-1偏移的特征性光谱变化；Sánchez等[21]观察到氧化性损伤后，精子nDNA拉曼光谱的1 050/1 095 cm-1比值与DFI比例呈线性相关，内源性脂质的亚甲基谱峰1 446 cm-1也发生改变，表明无论是紫外线还是氧化诱导的nDNA损伤不仅造成DNA结构断裂，而且也导致精子的脂质受损。Li等[22]比较了牛冻融精子核的拉曼光谱，发现与新鲜精子相比，冻融精子核的光谱在属酪氨酸和胞嘧啶的785 cm-1谱峰处以及代表PO2-1骨架的983 cm-1和1091 cm-1处强度升高，表明冻融过程会损伤精子核。由于之前精子nDNA的拉曼光谱研究都是在涂片上使用单独的风干精子进行的，而风干精子不适合随后的使用或生理学研究，因此有必要评估水及溶液中化合物等介质是否对精子nDNA拉曼光谱产生影响，为真正客观的精子选择奠定基础。Da等[23]利用多种条件来揭示不同水合条件和紫外线照射下精子核的拉曼光谱特征，发现与精子核相关拉曼光谱图性能稳定，但代表紫外光照射造成DNA损伤的光谱只在干燥条件下才能观察到。
精子线粒体功能异常与低生育力相关[24]，拉曼光谱在精子线粒体状态的研究中已展现出一定的潜力。Meister等[25]用532 nm激发光的拉曼图谱成像明确区分了人精子的头部（788 cm-1）和富含线粒体的中段（751 cm-1），并发现在不同程度紫外照射下线粒体中段损伤先于头部。Amaral等[26]发现4种不同物种精子拉曼光谱的主光谱模式有高度相似性，并描述了与线粒体脂代谢、呼吸链等相关的中段特征性拉曼峰~743 cm-1、~1 109 cm-1、~1 364 cm-1、~1 396 cm-1、~1 519 cm-1、~1 546 cm-1和~1 583 cm-1，可以作为生化标志评估精子的线粒体状态。Li等[22]发现与新鲜精子相比，牛冻融精子的光谱在与葡萄糖相关的谱峰926 cm-1处升高，冻融过程会给精子带来亚致死损伤，线粒体活性降低，导致精子冻融后运动活力差。
精子中的表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNAs（noncoding RNAs，ncRNAs）和精蛋白等，在精子发生、受精和胚胎发育中都起着非常重要的作用。表观遗传修饰异常参与了男性特发性不育的病因，直接影响精子质量及受精后胚胎的发育，导致早期流产、胚胎发育异常，甚至诱发后代表观遗传疾病的发生。对精子进行表观遗传修饰研究有助于理解男性不育或生育力的分子机制；建立精子的表观遗传评价标准指导ICSI中的精子选择，对于提高辅助生殖的临床结局，避免后代表观遗传疾病的发生具有重要的意义。既往检测精子的表观遗传修饰检测通常经过染色、免疫细胞化学的处理，检测后精子不能用于后续的体外受精（in vitro fertilization，IVF）或ICSI。拉曼光谱能够无创性评估DNA、RNA以及组蛋白和鱼精蛋白等表观遗传修饰，在评价用于ICSI的单个精子特异信息，进行精子优选具有很好的前景。Huser等[27]利用拉曼光谱对精子细胞的染色质的鱼精蛋白包装效率进行评估，发现头部形状异常的精子其鱼精蛋白与DNA的包装存在错误，推测鱼精蛋白的包装异常可能是导致精子功能异常的原因。Poplineau等[28]用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理Jurkat细胞，比较了光镊拉曼光谱、组蛋白电泳和核图像细胞计数仪对组蛋白修饰变化检测的敏感度，发现光镊拉曼光谱可以高可信度地从对照组中辨别出组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的细胞。虽然该研究材料非精子，但已初步表明拉曼光谱可用于识别经历表观遗传变化的活细胞，有望应用于精子的表观遗传修饰标志物评估和精子选择。
除了上述检测分析外，拉曼光谱还可以评估单个曲细精管状态，有助于提高显微取精的取精率。研究人员用拉曼光谱技术非侵入性地评估了NOA和梗阻性无精子症（obstructive azoospermia，OA）患者的生精小管是否有活跃的精子发生，比较二者精子发生的微环境的差异，发现拉曼光谱技术可区分小鼠的正常生精小管和只含支持细胞的生精小管，敏感度和特异度高达91.2%和82.9%[29,30]。Ma等[31]发现NOA和OA患者支持细胞光谱强度有4处存在统计学差异，其中1 086 cm-1谱峰与糖苷键相关。此外，拉曼光谱技术在前列腺的研究上也有广阔应用，目前的研究方向主要在前列腺癌标志物的鉴定和无创筛查前列腺癌上[32,33]。
拉曼光谱技术以快速、无创、对样品无损和灵敏度高等特点在生物医学领域中显示出巨大的优势，有望成为评估男性生育力及挑选精子的标准化技术。然而该技术在男性生殖领域中的应用目前仅处于起步阶段，向临床的转化还需不断地实践和探索，其安全性和临床有效性还有待更多大样本数据的验证
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原作者: 刘雪丽 常椿欣 徐晨明
来源: 中华检验医学
