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上一次我们的好朋友“黑夜孤狼”发表了一篇Western blot 条带分析的好文章，不仅简明扼要的指出了WB中常见的问题，还提供了解决方法，特别适合大家分析问题，对号入座。为了不厚此薄彼，艾美捷老司机也为受困于免疫荧光（IF）的同胞们谋个福利~ 以下就是对于免疫荧光（IF）常见问题及优化方案详细解答： | 问题 | 可能原因 | 优化方案 | 信号弱或无信号， 染色细胞过少 | 目标蛋白在细胞中没有表达 | 制备细胞裂解液，用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达 | | 表达目标蛋白的细胞过少 | 标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定转染细胞系 | | 细胞通透性差 | 增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其它的通透剂 | | 染色前的固定步骤破坏了抗原表位 | 改用其他固定方法 | | 通透使抗原丢失 | 减少通透剂作用的时间或强度 | | 抗体不识别 | 换用其他抗体 | | 一抗稀释度过大 | 同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 | | 二抗选择错误 | 使用正确的二抗 | 背景过高 | 一抗质量不高 | 使用特异性高，效价高的一抗 | | 一抗浓度太高 | 同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例 | | 二抗浓度太高 | 同一样品按最佳的一抗用量作二抗稀释曲线，以确定最佳的二抗稀释比例 | | 封闭不完全 | 使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭；改善封闭条件 | | 封闭液BSA中含IgG | 使用高纯度（IgG free）的BSA | | 洗涤不充分 | 充分洗涤 | 细胞呈扁平状 | 细胞片被风干 | 在任何时候都不要让细胞片干燥；使用湿盒 | | 使用了甲醇固定 | 甲醇可破坏细胞膜，因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛等其他固定剂 | 细胞有自发荧光 | 使用了戊二醛固定 | 在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 | | 材料本身（如石蜡）有自发荧光 | 细胞模糊，封片剂明亮 | 因洗涤不充分导致背景太亮 | 充分洗涤 | | 二抗结合太弱 | 确保抗体牢固结合，确保固定良好 | 整个细胞片都出现荧光亮点 | 二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 | | 二抗发生沉淀 | 过滤或离心荧光标记二抗 |
以上所提供的是一种简略的问题查找方案，更好的实验结果还是要同志们再次实验尝试的，其中实验试剂的品质也是非常重要的一个环节。老司机在此为您推荐一些用的上的好产品，助一臂之力！ | 产品 | 用途 | 货号 | | Normal Donkey Serum | 驴血清，封闭佳品 | 017-000-121 | | Normal Goat Serum | 山羊血清，封闭佳品 | 005-000-121 | | Normal xxxx Serum | 更多封闭血清产品 | 咨询艾美捷科技 | | IFKine Green Donkey Anti-Mouse IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24211 | | IFKine Green Donkey Anti-Rabbit IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24221 | | IFKine Green Donkey Anti-Goat IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24231 | | IFKine Orange Donkey Anti-Mouse IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24311 | | IFKine Red Donkey Anti-Mouse IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24411 | | IFKine Red Donkey Anti-Rabbit IgG | 针对IF优化后的二抗 | A24421 | | 更多Dylight 系列荧光二抗 | 多彩二抗随心选 | 咨询艾美捷科技 | | 高纯牛血清白蛋白（BSA）粉末（IgG free） | BSA中的封闭极品 | BAH67 | | 更多实验试剂需求...欢迎咨询 | 您的忠实伙伴 | 艾美捷科技 |
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