多重免疫荧光分析

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

这种多重免疫荧光分析的总体目标是根据细胞表型自动计数细胞。 此方法允许多谱段和自动细胞计数从而分析肿瘤免疫细胞在肿瘤微环境内的表型和功能。

本期实验采用通过多重免疫荧光技术来表征CD8+T细胞的表型和矿物相互作用。

（一）免疫染色

实验步骤：

1. 解冻后，用纸巾仔细擦干组织切片周围的载玻片并用疏水屏障笔涂抹组织。当染色干燥后，将样品放在100％丙酮中固定5分钟随后风干两分钟。

2. 在TBS中清洗载玻片10分钟，用3滴0.1％抗生物素蛋白预处理载玻片10分钟，然后轻敲或滑动载玻片以用抗生物素蛋白溶液覆盖组织向每个样品中加入三滴0.01%的生物素。

3. 按照上述步骤用TBS清洗，在室温下用含100微升5％正常血清的TBS，阻止任何非特异性结合30分钟。在孵育结束后，敲击载玻片以除去多余的血清并将载玻片在100微升的抗体鸡尾酒中并在潮湿的环境中孵育1小时。

4. 用TBST清洗载玻片5分钟后干燥载玻片，在潮湿的环境中，用100微升二抗抗体鸡尾酒标记细胞30分钟，然后用TBS清洗10分钟，将干燥的二抗标记的载玻片与100微升三抗抗体鸡尾酒孵育30分钟。

5. 最后用TBS清洗10分钟，在洗涤结束时干燥载玻片并用含封固剂的DAPI封固组织，然后用盖玻片盖住每张玻片封固至少两个小时。

（二）载玻片扫描

实验步骤：

1. 首先打开显微镜软件并加载图像扫描协议。将第一张载玻片放到显微镜台上然后在控制栏中，单击设置曝光并调整每个滤镜的曝光时间，直到获得足够的饱和信号为止。

2. 输入第一张载玻片的ID，以4倍放大率获取亮光下的载玻片概览，单击单色成像并找到标本，选择要扫描的组织区域，用4倍放大倍率查看相关区域并获取每个区域的荧光红蓝绿色图像。

3. 单击低功耗成像，若要选择高功耗成像，需至少选择5个相关区域并用以20倍放大率扫描的组织区域。

4. 然后获取每个区域的多光谱图像采集，单击高功耗图像和数据存储将图像存储在相应的实验室ID文件夹中。

（三）图像分析

实验步骤：

1. 在文件菜单下创建一个新项目并查找功能菜单下，选择细胞分割，在表型菜单下，选择表型，然后点击配置。

2. 在图像格式中，选择多光谱；在示例格式中，选择荧光，要将代表性图像集成到文件菜单下的项目中，需单击打开的图像并选择整个系列的10-30个代表性图像；要去除自发荧光，请打开未着色的载玻片并选择库源。

3. 在适当的荧光团中，点击自发荧光并在空白载玻片上选择自发荧光区域；要生成合成图像，请选择全部准备。

4. 要整合荧光库和自动荧光光谱，请单击眼睛图标以打开视图编辑器面板并取消选择自发荧光，以修剪自动荧光信号为每个标记选择合适的颜色；要细分细胞隔离菜单中的细胞，请选择细胞核和膜。

5. 在核素菜单下，将DAPI设置为核复染，点击分离细胞并检查细胞核和细胞膜的分离；为了表型细胞，在表型菜单下，请在植物区系4和植物区系4组合选择多于5个的代表性细胞。

6. 然后在“Train classifier”分类器创建一个算法，用一个置信区间为每个细胞指定一个表型放大并检查细胞的表型，然后点击全部表型。

7. 为了保存表型算法和图像，在文件菜单下选择保存项目，然后命名该项目并保存。要执行批次分析选择已保存的项目，选择一个用于存储批处理分析数据的文件夹，添加要分析的图像，然后点击运行。在分析结束时，检查合成图像的质量并验证系列中所有图像的表型。

具体的实验操作流程，请点击最下方视频观看哦~~

代表性肿瘤内PD-1+ Tim-3+ CD8+T细胞定量和分析结果：

通过荧光多光谱成像分析，肾细胞癌样本中的肿瘤浸润CD8+T细胞显示了大约一半的CD8+T细胞对于PD-1是单阳性的，并且约有1/3对于PD-1和Tim-3是双阳性的。

在将这些不同细胞信号整合到组织切片上之后，PD-1+ Tim-3+相对于PD-1+ Tim-3+ CD8+T细胞的比较，显示了当Tim-3共表达时，PD-1荧光增强，从而加强了Tim-3表达功能的相关性。

在该代表性实验中，66％的肾肿瘤患者对于PD-1配体表达也是阳性的，并且全部对Tim-3配体Gal-9呈现阳性。

来自肾细胞癌患者的肿瘤组织的临床评分也证明肿瘤侵袭CD8+T细胞，而表达PD-1和Tim-3的数量和百分比与预后评分参数成正相关，而不与未表达Tim-3的PD-1+CD8成正相关。

如上所示，共同表达PD-1和Tim-3的CD8+T细胞高于中间值百分比的肾细胞癌患者更可能复发，然而没有Tim-3表达的PD-1表达与患者复发没有相关性。