6 大步骤帮你搞定免疫荧光化学

免疫组化是门很复杂的学问，同时也是一场浩大的工程。在常规的生化实验当中，说它是最复杂的小实验也不为过，真正诠释了细节决定成败。当然，免疫组化的概念其实很大，本文所提及的只是免疫组化中的免疫荧光化学。

冰冻切片 or 石蜡切片

免疫组织荧光，一定首选冰冻切片而非石蜡切片。两者的区别主要在于冰冻切片能较完整地保存抗原免疫活性，但组织结构会受到冰晶等的影响而变形，石蜡切片则相反。虽然石蜡切片可以做抗原修复，但是，它不是麻烦嘛！所以想听冰冻切片做免疫荧光的故事，请继续拜读，啊呸，垂阅下文。

灌流和固定

4% PFA 动物心脏灌注。

如今实验动物多为啮齿动物，以 SD 大鼠为例：

麻醉，固定头和四肢，开胸腔，暴露心脏，灌流针插入左心尖（也就是左心室），右心耳剪个小口同时打开蠕动泵开关开始灌流，先 PBS 后 PFA，最后解剖目标组织于 4% PFA 中浸泡，4 度 24 h。

麻醉和开胸腔不用说。灌流针插入心尖的时候，理论上应插到主动脉附近，但实际上此操作很容易插错从而进入肺循环导致灌流失败，所以此时可以使针尖刚刚穿过心尖到达左心室即可。接着，右心耳剪口，开启灌注，两者保持一致。

注意，灌流时管道不允许有气泡。PBS 灌流结束标志以肝脏变白和流出澄清液体为准，PFA 灌流成功标志位肝脏变硬为准，灌得好的大鼠四肢会抽搐几次，成年 SD 大鼠 250 ml PBS 和 250 ml PFA 足矣。

现今灌流多为 PFA，没有争议，但有人提出将 PBS 和 PFA 4 ℃ 预冷再进行灌注效果更好，我没有试过，但我觉得室温亦可。也有人做免疫组化不需要灌流，但那都是小组织，一般情况，灌一定是比不灌固定效果要好的。

 脱水

10%，20%，30% 蔗糖的 PBS 溶液梯度脱水。

脱水这一步直接关系到后面切片的冰晶的形成，脱水脱不好则冰晶较多，片子空洞较多，结果相当丑。此时应使溶液的体积超过数倍于组织的体积，沉底即可换液，直到组织块在 30% 的蔗糖溶液中沉底。沉底后就不要放置太长时间了，应迅速进行下一步。

也有人直接用 30% 蔗糖溶液脱水，不过直接用高浓度溶液脱水极易引起组织皱缩、变形而影响切片。当然我对比过两种方式其实区别不大，但我还是建议梯度脱水，因为谁也不能保证在你自己的实验条件下也差别不大，况且高浓度直接脱水沉降时间会很长，其实没有节省很多时间。

包埋

组织块修好后放入合适的包埋盒，加入 OCT 包埋剂，液氮或干冰速冻，放入 -80 冰箱保存。

现在普遍用 OCT 包埋剂（optimal cutting temperature compound），是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，目前已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。又因 OCT 混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色。

网上也有一些廉价的自制包埋剂，比如说胶水？不知效果如何，我不太看好。包埋剂填充的时候记得不要有气泡，尤其是组织周围。接着就是速冻，速冻这一步很关键，也是直接关系到后期片子空洞的形成。

这里有一种理论，一般认为冰晶小而多时，对组织结构损害较大，而冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，而冰晶的成核率在速冻降温后直至 -30 ℃～-43 ℃ 时达到最大，之后再减慢。于是，我们可以通过减少降温过程中 -30 ℃ 至 43 ℃ 的持续时间来控制冰晶的形成过程。

所以，我们就需要一个超低温环境来速冻。据我的经验，-20 ℃ 和 -40 ℃ 冰箱肯定不行，-80 ℃ 冰箱也会不如意，会有很多空洞出现。毕竟其环境温度虽然达到了但是接触物多半为空气，导热性差，此时可以放置一个金属块在里面预冷，再将包埋盒放置其上，情况会好很多，干冰速冻也可采用这种办法。

而最好的办法肯定是液氮速冻，但也有个缺点，就是容易使包埋块变脆，所以这里值得注意的就是浸入液氮的时间保持很短就可以了。底部浸没，不需完全淹没，几秒到十几秒，包埋剂变白，然后立即放入 -80 ℃ 冰箱，一般大小的包埋块都可搞定。

如果非要切很大的组织块，那也不用等到其从里到外完全变白，因为那样时间依然很久包埋块会变脆，此时只要包埋块外层变白即可放入 -80 ℃ 冰箱，所以不建议切大块组织，一般的免疫组化实验没有这个必要，比如说大鼠的脑子就很大，即使全脑切冠状切片，也只要取你想要的区域分段切就好。

切片和贴片

切片是一门学问，不练几个月你是没法入门的。而且这也不是光看文字就能学会的。

你的操作习惯与你切片机的型号密切相关，这里也不多讲。但万变不离其宗，切出来的片子的好坏与你包埋的好坏、机器各部分之间的角度和距离等参数和你的操作习惯的好坏是密切相关的。

这里不说流程，简单说几个注意事项：

第一，修块最好是矩形或梯形；

第二，切片时先慢后快；

第三，贴片时利用玻片对组织薄片的自然贴合力，不要用蛮力。贴片后稍稍晾干，-80 ℃ 保存。片子使用前最好在 -20 ℃ 复温 1 h。

免疫荧光

漂洗，封闭，敷一抗，漂洗，敷二抗，漂洗，封片，镜检。

所有的免疫荧光基本上就这一套流程。先说洗，怎么洗？溶液刚好浸没载玻片，摇床漂洗，洗三次。不用怕掉片，只要你买的多聚赖氨酸预处理的载玻片质量过关，在保质期内（是的，直到我用了过期的玻片