PCR如何应付非特异性扩增，教你两手！

小林子最近做PCR的时候经常唱着这样怪异的歌（请按照“白龙马蹄朝西”的曲调自行脑补），他说这是他神师兄（沈青刚师兄）教他的，做PCR就不会出错了。也难怪，刚开始学做构建的小林子经常会在PCR的过程中出错，要么是少加引物，要么是忘了加dNTP。

　 　 但最近小林子的过表达载体构建一直出问题，目的片段一直扩增得量很少，也不知道是为啥，会有大量的二聚体及非特异性扩增。莫愁正巧又出差去开会了，真心是找不到人问啊。于是实验室的不速之客神师兄又悄悄滴来到了小林子的背后……停，这不是毫无节操的捡肥皂节奏……好了，说正经的，神师兄出来给小林子出主意了。

　 　 神师兄：小林子啊，你这个情况，那么多二聚体，就是有引物间非特异性结合。这样肯定就扩增不出目的片段了！

　 　 小林子：神师兄，那这是为啥呢？

　 　 神师兄：你这就不知道了，啥是引物二聚体，其实就是引物在错误退火后，自我扩增出来的。也就是非特异性扩增，引物在退火过程中产生了hairpin结构或其他二级结构，就很容易产生这样的扩增。或者引物在模板的某些位置非特异性地结合，也同样会产生非特异性扩增。我们都知道，PCR产物都是通过引物延伸产生的。当引物产生了二聚体或者非特异性扩增产物之后，引物本身就无法再延伸形成PCR产物了，等于废掉了。这样的情况下，非特异性扩增产物越是多，那目的产物就越是少。如果在qPCR过程中，就会在熔解曲线中形成双峰。

　 　 这种情况下，就需要降低引物可能产生的二级结构。正是由于存在引物间的二级结构，才导致了二聚体的形成。听我的没错，你在体系里加DMSO就行了！这种都是我实验的秘笈啊！一般不外传的！

　 　 小林子：真的么，神师兄，多大浓度的DMSO啊？

　 　 神师兄：10%左右的吧，你自己摸摸浓度看。DMSO是用来降低二聚体的，加进去可以防止DNA二级结构的产生的，引物和引物之间不产生二级结构，也就是说不会有引物聚合而产生引物自我扩增的二聚体了。完美吧，这种方法我百试百灵的！谁用谁知道啊！

　 　 过了几天，小林子的试验还是没有起色……

　 　 神师兄：小林子，扩增的咋样，DMSO是不是杠杠的！

　 　 小林子：还是不行啊，加了还是扩增的不好咋办？

　 　 神师兄：这样啊，那你要加点EDTA进去，降低PCR里的镁离子试试看，镁离子就是导致PCR非特异性扩增的元凶。镁离子浓度越高，二聚体扩增就越猛烈。EDTA这样的螯合剂加进去，直接就降低镁离子浓度，别跟你莫愁师姐说这是我告诉你的啊，一般人我不告诉他！

　 　 小林子：这要多大浓度呢？

　 　 神师兄：这个啊你看着弄吧，和镁离子浓度差不多就行。

　 　 小林子经过一系列的试验之后，二聚体居然和奇迹般的神师兄一样，也再没出现过，但目的条带也和神师兄一样消失了……