PCR仪操作与维护，给你提炼一篇

简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。

目前，常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。

尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 

1.戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 

2.使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 

3.避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 

4.操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 

5.最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 

6.操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 

7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。

如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 

8.重复实验，验证结果，慎下结论。

现象：正对照有条带，而样品则无

原因：
1、模板:含有抑制物，含量低
2、Buffer对样品不合适
3、引物设计不当或者发生降解
4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策：
1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2、更换Buffer或调整浓度
3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4、降低退火温度、延长延伸时间

现象：条带与预计的大小不一致或者非 特异性扩增带

原因：
1、引物特异性差
2、模板或引物浓度过高
3、酶量过多
4、Mg2+浓度偏高
5、退火温度偏低
6、循环次数过多

对策：
1、重新设计引物或者使用巢式PCR
2、适当降低模板或引物浓度
3、适当减少酶量
4、降低镁离子浓度
5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6、减少循环次数

现象：产物在凝胶上呈Smear状态

原因：
1、模板不纯
2、Buffer不合适
3、退火温度偏低
4、酶量过多
5、dNTP、Mg 2+浓度偏高
6、循环次数过多

对策：
1、纯化模板
2、更换Buffer
3、适当提高退火温度
4、适量用酶
5、适当降低dNTP和镁离子的浓度
6、减少循环次数

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：
靶序列或扩增产物的交叉污染

对策：   
1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存

需要注意以下问题：

实验室使用的基因扩增仪，荧光定量PCR仪都是高精度仪器。一旦仪器出现一些温度或者检测上的小偏差，则很可能对实验结果产生较大的影响。因此，学会日常保养和维护是尤为重要的。

 仪器应安放在湿度较低、灰尘较少并远离水源和热源的地方，无腐蚀性气体或强磁场干扰。

环境温度建议在18~35℃之间。仪器之间应保持50cm 以上距离，降低仪器之间的影响。

用95%乙醇配合棉签、无尘布等工具，清洁样品台。之后运行PCR仪，设定保持温度为50℃，约5~10min，让残余液体挥发去除。

另外，热盖也应该用酒精或纯水定期清洗，确保热盖清洁，温控性能良好。对于荧光定量PCR，清洁样品台和热盖的同时，去除灰尘等杂物，保证光路清洁，降低信号干扰。

老款的PCR仪的性能比不上新款仪器，使用前需要进行预热，不仅对仪器维护有好处，还能节约实验时间。新款的仪器升温快，但还是建议最好能在进行实验前预热2min，这样可以有效延长仪器的使用寿命。

1.PCR仪器需要定期检测，视制冷方式而定一般半年至少一次。

2.PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的，当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1～2℃时，可以运用温度修正法纠正PCR实际反应温度差。

3.PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制，要求越短越好，当PCR仪的降温过程超过60s，就应该检查仪器的制冷系统，对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘；对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。

4.一般情况如能采用温度修正法纠正仪器的温度时，不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件，必要时要请专业人员修理或利用仪器电子线路详细图纸进行维修。

另外，由于生产厂家和仪器型号的不同，仪器在保养上也会有差异，有些荧光定量PCR仪，采用底部检测的模式，平时使用仪器附件中的橡胶风球吹去样品台上的灰尘等。必要的时候，可以用棉签沾取无水酒精清洁，但需要注意不要把液体滴入检测孔中，防止影响里面的光路部件。

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