PCR、RT-PCR、qPCR、Real-Time PCR、RT-qPCR..... PCR,学名聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction),心灵手巧的它能以织围巾的方式将DNA分子套牢。在织围巾(PCR)的过程中,将几个元素织样(模板)、起针(引物对)、毛线(dNTP)和针(Taq酶以及缓冲液体系)串起来,让DNA分子无处可逃。 原理: 1、在高温(94℃)时将织样拆解开(DNA双链解链), 2、将已经织好的起针与织样相匹配(退火将已合成的引物与单链模板相结合),按照织样(模板),沿着起针(引物)用毛衣针(Taq酶)将毛线(dNTP)一针针连接上去(72℃延伸扩增)。 3、通过对所有织样(包括原先的模板及新形成的模板)的拆解(解链)及新的起针(引物)搭配(结合)、编织(Taq酶扩增)这样循环n次后,围巾的数量就以2的n次方(产物量就以2的n次方)增多了。 如此,狡猾的DNA分子就只能在不断重复的热变性—复性—延伸的过程中束手就擒了。 如果你正在进行常规PCR实验,那么Promega推出的: GoTaq G2 Polymerase and Master Mixes(M7822、M7832)就很合适了,它是即用型预混液,仅需加入模板、引物即可进行反应; 操作简单,极大的节省了科研用户的时间! RT-PCR(指反转录PCR) 原理: 作为PCR的一种变形反应,通常会先在逆转录酶的作用下将RNA逆转录为DNA,再通过PCR进行扩增; 而想要实验效率高,可以选择: GoScript Reverse Transcription Systerm (A5000) 它可在15min内高效的将RNA逆转录为DNA,仅需提供模板即可实验。 qPCR、Real-Time PCR、RT-qPCR; 前面介绍的方法只能定性不能定量。要论定量,在PCR领域中,qRCR (quantitative real-time PCR) 称第二,谁又敢称第一呢! 目前在科研界中将Real-Time PCR缩写为 qPCR,已成为一种约定俗成的事; 而RT-qPCR指的就是qPCR和RT-PCR的组合,即将RNA 逆转录为 cDNA 后再作为模板进行实时荧光 PCR 分析。 那么究竟qPCR身负何等绝技,引得一众科研者如此看重呢? 其实相比于PCR的简单“围巾”织样,qPCR因天生自带光环(荧光染料嵌合法和荧光探针法),可将这件围巾瞬间美化为“荧光衣”,使得荧光与DNA产物数目成正比,且与DNA初始量有一定相关性。
关于水解探针法,GoTaq Real-Time qPCR and RT-qPCR Systems for Probe-Based Detection (A6101、A6102)可是专业的! 它是专门为采用水解探针方法进行定量PCR实验而设计并优化的系统; 探针完整时报告基团发射的荧光被淬灭基团吸收,仪器检测不到荧光,探针被切断后,报告基团与淬灭基团分离,报告基团的荧光被仪器检测到。 若要对RNA表达水平进行相对定量分析,可以选择: Go Taq Probe 1-Step RT-qPCR Systerm (A6120) , 该系统结合GoScript逆转录酶和GoTap探针法定量PCR预混液,采用一步法实时扩增进行逆转录-定量PCR反应。 若想要效率更高,荧光强度更强,可以选择: GoTaq Real-Time qPCR and RT-qPCR Systems for Dye-Based Detection(A6001、A6002), 该系统中新型荧光DNA结合染料与双链DNA结合后,对PCR抑制更小,PCR效率更高,荧光强度更强。 关于染料法,也有针对一步法定量分析RNA的试剂系统Go Taq 1-Step RT-qPCR Systerm (A6020),它更适用于高通量样品检测。 因此只需通过机器收集荧光量就能知道DNA或RNA初始量。 |