免疫组化的标准步骤

免疫组化步骤（ABC法）

1、4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后； 

2、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3； 

3、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3； 

4、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3； 

5、加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3； 

6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次； 

7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应； 

8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。 

免疫组化SP法步骤：

SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.

按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。 

一般的sp法步骤啊,具体如下：

1、烤片，68℃，20分钟,

2.、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min 

3、阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；

4、 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。

5.、正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.

6.、滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；

滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

7.、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

8.、DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，

苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

免疫组化（Elivision二步法）：

（1）石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。

（2）取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)

（3）每张切片加1滴3% H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

（4）除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。

（5）PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。

（6）除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’

（7）除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5分钟。

（8）苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

注：即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒，购自福州脉新生物技术开发有限公司。包括：生物素化抗兔二抗、亲和素（Reagent A）、生物素－辣根过氧化物酶（Reagent B）、二氨基联苯胺（DAB）