一文读懂——瑞氏染色

瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲合作用，又有物理吸附作用。各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的亲合力也不一样，因此，染色后各种细胞呈现出各自的染色特点。

如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质。

细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料亚甲蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质。

中性颗粒呈等电状态与伊红和亚甲蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质。

原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色，完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。

瑞氏染料由酸性染料伊红（E）和碱性染料亚甲蓝（M）组成。伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝 (又名美蓝) 为四甲基硫革染料，有对醒型和邻醒型两种结构。通常为氯盐，即氯化亚甲蓝，有色部分为阳离子。亚甲蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）。将适量伊红、亚甲蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解亚甲蓝和伊红，二是固定细胞形态。

瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成。将瑞氏染料放人清洁干燥研钵里，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒人棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醉全部用完为止，即为瑞氏染液。

配好后放室温，周后即可使用。新配染液效果较差，放置时间越长，染色效果越好。久置应密封，以免甲醉挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油 2~3 mL，除可防止甲醇过早挥发外，也可使细胞着色清晰。

磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)：0.3 g

磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄)：0.2 g

加少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水加至 100 mL。

血涂片是血液细胞学检查的基本方法，应用极广。特别是对各种血液病的诊断有很大价值。但血片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。

常规使用薄血膜退片法，可分为采血、制备血涂片、干燥三个步骤，如下所示：

左侧小血滴是5ul的，右侧大血滴是50ul的。

不少资料都在这里犯了错误，比如全国临床检验操作规程第3版/第4版都说取0.05ml血（50ul），从上图不难看出，这么多血是不可能制备出良好血涂片的；推荐取5ul左右，最好是不抗凝的静脉血或者手指血；EDTA抗凝血也可用，但并不是最好的选择。

1.pH值对细胞染色有影响。细胞的各种成分均由蛋白质构成，蛋白质均为两性电解质，所带电荷随溶液pH而定。因此，染色时需要注意控制溶液的pH值，以保证染色的准确性。一般来说，使用缓冲液来调整pH值，使其保持在6.8左右。

2.未干透的血膜不能进行染色，否则染色时血膜容易脱落。同时，染色时间的长短与染液浓度、染色时温度及血细胞数量有关。需要根据染液浓度、染色时温度和血细胞数量来调整染色时间。

3.冲洗时不能先倒掉染液，应该用流水冲洗，以防染料沉淀在血膜上。同时，如果血膜上有染料颗粒沉积，可以用甲醇溶解，但需要立即用水冲掉甲醇，以免脱色。

4.如果染色过淡，可以复染。复染时需要先加缓冲液，创造良好的染色环境，然后加入染液或染液与缓冲液的混合液。

5.如果染色过深，可以用水冲洗或浸泡水中一定时间来降低染色深度。也可以用甲醇脱色，但需要立即用水冲掉甲醇。

6.当发现染色偏酸或偏碱时，应该更换缓冲液再重染。同时需要注意缓冲液的质量和浓度是否符合要求。

7.瑞氏染液的质量好坏可以通过吸光度比值（RA）来评价。一般来说，瑞氏染液的成熟指数以RA=1.3±0.1为宜。如果RA值不符合要求，需要更换新的瑞氏染液或者调整染液的浓度。

染色良好的血膜片，外观呈浅红色，红细胞呈粉红色，白细胞核呈暗紫红色， 染色质结构能辨，粒细胞的颗粒呈固有种异颜色。

染色时间应视具体情况而定，特别是更换新染料时必须经试染，摸索最佳染色条件。