前几天发了一篇文章，PCR 实验室污染？别急，教你万能应急法！今天给大家继续分享 PCR 实验中遇到的问题！
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。你在做 PCR 实验的时候遇到过哪些问题？来看看前辈们的经验。检测结果遇到没有 Ct 值情况,排查是否有以下问题:1、循环数不够(一般不超过 45 循环，不仅背景值提高,定量也不准);2、PCR 程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般 SG 法采用 72 ℃ 延伸时采集，TaqMan 法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中。3、引物或探针降解。可通过 PAGE 电泳检测引物和探针是否降解;4、模板量可能降解或上样量不足(不超过 500 ng，根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解，应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样本小量分装储备，避免反复冻融;5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物 Tm 值超过 4 ℃ 以上也会影响扩增)。在相对定量中, Ct 值一般控制在 15 ~ 25 之间比较好，如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品，Ct 值会增大, 但是一般不宜超过 40 循环, 否则定量不准确。因此，判断 Ct 值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；2、PCR 程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长 10 s)；3、MgCl2 浓度不合适，增加镁离子浓度等。PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足；4、PCR 产物太长。PCR 产物设计超过 500 bp；5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行 PCR 检测或将模板进行稀释。 照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。2、引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。3、镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的 mix 试剂盒。4、模板有基因组的污染。RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。5、交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染, 或操作环境中有气溶胶造成污染, 建议对操作环境进行处理, 或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。 标准曲线线性关系不佳 R2 < 0.9，很有可能是以下环节存在问题:2、标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度 DNA 模板分装,保存于 -20 ℃ 或 -80 ℃，现配现用。3、引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针。4、模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量以 50 ~ 500 ng 为宜。 1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳, 尤其是涉及二聚体存在时, 适当降低引物浓度, 并注意上下游引物的浓度比例;2、模板有基因组污染。RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入, 或通过引物设计避免非特异性扩增。3、离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度, 或选择更适合的 mix 试剂盒, 不同试剂盒在该方面的优化能力不适合, 有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果。 遇到扩增曲线异常，比如 S 型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题：3、在操作荧光定量 PCR 时，带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等。4、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:1、反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解。2、反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间。3、反应体系中有 PCR 反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影响。 |
