实时荧光PCR：内标定量与外标定量的差异

实时荧光定量PCR中样本的浓度对数值（log 值）与扩增曲线 Ct 值呈线性关系， Ct 值越小，浓度越高。根据所采用的定量数学模型的差别，有外标定量法（外标法）和内标定量法（内标法）两种方法。

外标定量：使用一系列已知浓度外定量标准品（一般4-5个浓度梯度）与待测标本进行测定，通过标准品浓度的 log 值( y )和扩增的 Ct 值( x )间线性比例关系，可得到待测样本浓度值和 Ct 值的关系公式，简单理解即 y=Kx+B ，K 和 B 值需由外标准曲线获取，样本扩增 Ct 值( x )代入公式中即可算出待测样本的浓度值（ y ）。

内标定量：此处指已知浓度的标准品（即定量内标，1个浓度）与待测样本在同一管内扩增的方法，内标的浓度 log 值（y内）与 Ct内 有一个关系 K1 ，待测样本的浓度 log 值（y样）与扩增 Ct样 也有一个关系 K2 ，通过设计优化使样本和内标扩增效率一致，即 K1 = K2，则样本浓度 y样 可通过内标的浓度 y内 、两个 Ct内 和 Ct样 间的关系计算出，不同厂家 K 的算法模型有差异，相对复杂。

—      两种方法比较      —

        总结        

内标定量由于开发难度留给了设计者，用户层面结果分析更简单，结果由软件自动判读；因实验无需额外制作标准曲线，每次上机节约4-5人份试剂位，损耗更低，也是未来分子POCT实现定量的最佳方案。

外标定量通过测定一条标准曲线，按统一标准对所有孔样本相对“粗放”地定量，因而更容易适应不同设备系统，设计开发也更简单。两种方法各有优势。

题外话，为防止假阴性，要求每个反应孔中均需设置内标，用于监控样本核酸提取和扩增有效性，此内标在外标法定量体系中，仅作为孔内质控使用，在内标定量体系中，同时兼具定量功能。