胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识（2018版）（下）

第三部分　遗传实验室的遗传检测与质控

根据胚胎遗传检测的靶标，又可分为基因水平的检测和染色体水平的检测。

1　基因水平的检测

1.1　适用范围

经过规范的临床咨询，明确具有单基因遗传病高风险的夫妇；夫妻双方或之一携带有严重疾病明确的遗传易感基因致病突变；HLA配型选择。

1.2　检测策略和原则要求

1.2.1　为避免因扩增失败、优势扩增、等位基因脱扣(allele drop-out，ADO)、样本污染等导致的误诊或诊断不明，建议PGD的胚胎基因检测应同时进行突变位点的直接分析和遗传多态位点连锁分析[6,7]。

1.2.2　用于连锁分析的遗传多态位点可以是短串联重复序列(short tandem repeat，STR)或者单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphism，SNP)。

1.2.3　建议在致病突变位点上、下游1 Mb的范围内分别选择至少2个可提供遗传信息的多态位点，同时避免选择同源性高、相邻序列中GC含量高或有多聚核苷酸序列的SNP位点。

1.2.4　对于性连锁遗传病，建议加入性别指示位点的检测。

1.2.5　对于HLA配型者，用于连锁分析的遗传多态位点需要覆盖HLA-A、HLA-B、HLA-DRA和HLA-DQB1的上、下游，在每个区域中至少选择5个可提供遗传信息的多态位点。

1.2.6　在进行遗传多态位点连锁分析时，需注意突变位点附近的基因组重组。

1.3　检测方法

1.3.1　巢式PCR法

其中第一轮多重PCR应扩增多个目标位点(含突变位点以及连锁遗传的多态位点)。

1.3.2　全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)

又可分为基于PCR原理和非基于PCR原理的扩增方法。WGA扩增的产物可采用多种方法进行突变位点及遗传连锁位点的鉴定，包括荧光PCR、Sanger测序、单核苷酸多态微阵列芯片(SNP array)[8,9]、高通量测序(next generation sequencing，NGS)[6]以及联合检测等。

1.4　PGD检测前的验证

1.4.1　在施行PGD前，需要在家系样本中对已知致病突变进行验证。

1.4.2　应选择突变位点上、下游的多态位点，在家系样本中进行连锁分析，从中选择能够提供遗传信息的位点建立单体型图。

1.4.3　在单个细胞水平验证PGD检测方案的有效性

1.4.3.1　在实施PGD检测前，需要在单个细胞上验证方案的有效率，评估目标检测位点扩增的有效性以及ADO率。

1.4.3.2　验证样本可以是淋巴细胞、颗粒细胞、口腔粘膜细胞、胚胎细胞等，应注意来源的细胞可能影响扩增的效率和ADO率。

1.4.3.3　采用卵裂期活检者，每份验证样本应包含1个细胞；采用囊胚活检者，每份验证样本应包含4～10个细胞。

1.4.3.4　若采用直接PCR扩增法，建议在50份验证样本(可能的话，包括携带有致病突变的细胞以及正常细胞)中进行预验证检测。

1.4.3.5　采用WGA法进行第一步扩增者，建议至少在10份验证样本中进行预验证检测。

1.4.3.6　扩增效率应>90%，ADO率应<10%。若ADO率较高，可适当增加上、下游的连锁遗传多态位点进行分析[10]。

2　染色体水平的检测

2.1　适用范围

夫妻双方或之一携带有染色体异常；医疗目的的性别选择；胚胎植入前的非整倍体筛查。

2.2　检测策略和原则要求

2.2.1　对于夫妻双方或之一携带有染色体异常者，PGD可以仅针对异常染色体进行检测，也可同时分析其他染色体的数目异常。

2.2.2　性别选择可以用于基因诊断不明的性连锁遗传病。但对于基因诊断明确的家系，建议进行突变基因分析，不建议单纯进行性别选择。

2.2.3　对于Y连锁单基因疾病，可仅进行性别选择。

2.2.4　对于染色体结构易位，PGD检测可不鉴别携带者。有条件的实验室可以提供携带者检测，但需要充分评估检测所采用的技术。

2.2.5　对于胚胎非整倍体筛查，建议采用能够同时分析所有染色体数目异常的方法(comprehensive chromosome screening，CCS)，不建议采用FISH技术。

2.3　检测方法

2.3.1　核酸扩增法

2.3.1.1　巢式PCR法

首轮多重PCR应同时扩增目标染色体的特异性位点，第二轮定量PCR应进行各染色体位点拷贝数分析[11]。

2.3.1.2　WGA结合高通量遗传检测技术

在WGA检测后，可采用多种高通量遗传检测技术进行染色体拷贝数检测，如微阵列比较基因组杂交(array CGH)[12,13]、单核苷酸多态微阵列芯片(SNP array)[14,15]、高通量测序(NGS)[16,17]等。

2.3.2　FISH检测

应针对检测的目标染色体，选择不同的核酸探针。在检测染色体易位携带者所产生的胚胎时，所选的探针组合需要能够识别所有可能的易位相关的染色体不平衡胚胎。当染色体易位片段较小、超出高通量遗传学检测技术的有效分辨率时，应优先选择FISH检测。

2.4　临床实施PGD/PGS前对于方案有效性的验证

2.4.1　array CGH、SNP array、NGS等技术已有商品化试剂盒，具有标准化的操作流程和质控参数，本地实验室在首次临床应用前，需验证检测平台的有效性和稳定性。通常无需对每个病例进行临床前预实验。