胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识（2018版）（中）

第二部分　胚胎实验室的显微操作与质控

1　授精方式的选择

1.1　卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)

PGD/PGS周期建议采用ICSI授精方式，以最大限度地减少母源颗粒细胞和父源精子对下游遗传学检测准确性的干扰，特别是下游检测拟采用核酸扩增技术者。

1.2　常规体外受精(in vitro fertilization，IVF)

使用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)方法进行胚胎遗传学检测时，也可采用IVF授精后形成的囊胚，但应警惕精子和其他细胞核的污染。

2　活检的时机

2.1　极体活检

通过极体活检进行PGD/PGS，可分析判定母源遗传信息。

2.1.2　第一极体活检：可在取卵后实施，也可在ICSI后0.5～2 h进行。

2.1.3　第二极体活检：在ICSI后8～14 h第二极体排出后进行。

2.1.4　在ICSI受精后8～14 h内，可同时活检获取第一极体和第二极体。

2.2　卵裂期活检

卵裂期活检一般在授精后66～70 h进行，对此时发育至6～8细胞、碎片含量< 30%的胚胎进行活检。通常活检1个卵裂球，最多不超过2个。在卵裂期活检后，胚胎仍可继续生长发育2～3天，成为囊胚。在该时间段内若能完成胚胎遗传学诊断，则可实行新鲜周期移植。

2.3　囊胚活检

囊胚活检对胚胎发育的潜力影响较小，已成为目前PGD/PGS的主要活检方式。囊胚期活检是在授精后第5～6天、囊胚充分扩张后进行。建议活检囊胚评分应在4BB以上，活检细胞数以5～10个为宜。通常囊胚活检后的胚胎需立即冷冻保存，待胚胎遗传学分析完成后，择期对结果正常的胚胎进行复苏移植。

3　胚胎活检

3.1　透明带打孔

3.1.1　透明带打孔的方法有机械法、Tyrodes酸法和激光法。目前激光法更为常用，在活检时应尽量避免对细胞造成热损伤。

3.1.2　机械法打孔和激光法可以用于授精前的极体活检，Tyrodes酸法可能对纺锤体产生不利影响。

3.1.3　卵裂期或囊胚期活检可以采用机械法、Tyrodes酸法和激光法。

3.1.4　囊胚活检的透明带打孔可以在授精后第3天、第5天、活检前4 h或活检时进行。

3.2　活检细胞的数目　

应根据遗传检测的要求，单独或同时移取第一或第二极体；卵裂期活检应移取1～2个细胞。若需移取2个细胞，则活检胚胎应包含≥ 6个细胞；囊胚活检采集的滋养细胞数目应控制在5～10个。

3.3　二次活检

反复活检将影响胚胎的发育潜力。但在首次活检诊断不明时，可以考虑二次活检(包括卵裂期胚胎和囊胚)；如果胚胎活检后已冷冻，可以考虑复苏后再次活检[5]。

3.4　选择活检的细胞　

在卵裂期活检卵裂球时，应选择移取有核且为单核的细胞，囊胚活检应选择远离内细胞团的部位。

4　活检胚胎的冷冻

在等待PGD/PGS遗传学检测结果时，需要对活检后的胚胎进行冷冻保存。建议采用玻璃化冷冻技术，活检后的卵裂期或囊胚期的冷冻方法与常规胚胎冷冻方法相同。

5　活检样本的预处理

5.1　核酸扩增法检测的预处理

下游采用核酸扩增法进行遗传学检测者，活检所移取的细胞经过洗涤后应放入含有2.5 μL磷酸盐缓冲液(或遗传检测试剂盒所要求的预装试剂)的PCR管中，同时移取少许洗涤液到空白PCR管中作为空白对照。

5.2　FISH检测的预处理

不同的细胞固定方法均可以获得满意的效果；在处理时应注意做好固定液的隔离防护措施。

6　胚胎活检实验室的质量控制

6.1　胚胎活检环境的质量控制

6.1.1　同ICSI体外胚胎操作实验室标准，在百级层流、37℃恒温、覆盖于无菌矿物油下的无菌培养液滴中进行。

6.1.2　为减少胚胎之间的相互污染，必须确保每个微滴中仅包含一个胚胎，活检针和活检材料转移吸管须无活检细胞成分的残留。

6.2　胚胎活检人员的质量控制　

胚胎活检技术人员应具备熟练的ICSI操作经验，在操作中全程遵循严格的无菌原则，以防外源性污染。