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南京总医院 呼吸内科 施毅 主任医师 教授 目前，临床上对不同体液标本镜检和培养结果的判断价值仍存争议，现就这一问题进行探讨，以期为临床诊治提供参考。 1.临床标本获取和处理 1.1合格痰标本的获取和处理 痰是呼吸道感染病原学诊断最重要最常用的临床标本，而痰标本采集方法的正确与否、痰标本是否合格同样是真菌培养能否检出病原菌的关键。与细菌培养一样，真菌痰标本也应在临床怀疑肺真菌病及使用抗真菌药物之前采集，必要时应多次收集，并在2小时内送检，如不能及时送检应置于4℃保存，并在24小时内处理。目前临床送检痰标本的合格率仅在40%～60%。正确的方法采集方法是，嘱患者先行漱口，深咳嗽，然后留取脓性痰或分泌物送检。无痰病人如需检查肺孢子菌，可用高渗盐水雾化吸入诱导痰液。 痰标本处理应遵循先涂片检查后培养的下呼吸道标本病原学检测原则，但临床实际工作中人们通常只注重痰培养，而痰涂片镜检常常被忽视。必须强调的是痰涂片结果对临床有非常重要的间接和直接诊断价值。首先，涂片镜检能够筛选出合格痰标本。筛选时可挑取标本脓性部分涂片做革兰染色，当鳞状上皮细胞＜10个/低倍视野、多核白细胞＞25个/低倍视野，或两者比例＜1:2.5为合格痰标本。其次，痰涂片可行苏木精-伊红（HE）或相关特殊染色直接镜检寻找病原体。HE染色法是非特异性的真菌染色方法，能一定程度上提高菌丝的识别率。真菌特异性染色，如六胺银染色（GMS）和高碘酸-希夫染色（PAS染色）可应用于曲霉、毛霉和念珠菌等真菌病原体染色，且两者联合染色，能够进一步提高真菌病原体检出率[1]。呼吸道标本如发现曲霉或毛霉菌丝，念珠菌假菌丝和出芽孢子等临床意义较大。 1.2气道内吸引物的获取和标本处理 气管插管和气管切开患者，经人工气道吸引气道分泌物行镜检和培养是呼吸道感染病原学诊断的重要依据，可靠性高于痰标本。文献显示其病原学检测有很高的敏感度和特异度[2]。气管吸引术多采用盲吸法。在操作前应尽可能改善患者全身状况，充分给氧，如为呼吸机支持患者，可短暂给予纯氧吸入，防止操作过程中造成低氧血症。全部操作需遵循无菌原则，使用无菌吸痰管和痰液收集器，吸引前将负压调整至150～200mmHg（成人），操作应轻柔、敏捷，间断抽吸。标本处理基本同痰标本。 关于呼吸道分泌物的真菌半定量培养“12级法”和直接涂片检查“7级法”结果的准确性尚无大规模临床报道，但其分级报告结果能够为临床提供更多的参考价值。操作时选取呼吸道分泌物标本脓性部分分区划线接种血平板、巧克力平板和沙保平板各1个，同时直接涂片1张。巧克力平板于烛缸内放置，其它平板于普通孵箱内放置，35℃孵育48小时，观察菌落形态，分别挑取各种菌落、并于第一区混合涂片, 革兰染色，油镜检查。按下述“12级法”记录和报告细菌（包括真菌）培养结果：三个平板均无该种细菌（包括真菌）生长为（—）；仅在沙保或巧克力或血琼脂生长，或计数区内没有而非计数区内可见，或者于计数的各种菌落100个中某种细菌（包括真菌）菌落有1～4个，则判为少量（＜0. 1）；5～14个，为0. 1；15～24 个，为0. 2；25～34个，为0. 3；余者类推; 纯培养为1. 0。直接涂片革兰染色油镜观察, 首先判定标本质量，按下述“7级法”记录和报告涂片检验结果：真菌菌丝或孢子全片未见为（—）；＜3个/100个视野，为极少量；3～9个/100个视野，为少量；1～9个/10个视野，为（+）；1～9个/每视野，为（++）；10～99个/每视野，为（+++）；≥100个/每视野，为（++++）[3]。 1.3保护性毛刷采样和样本处理 相对于痰培养检查，经支气管镜引导保护性毛刷（PSB）技术或盲取法保护性毛刷（BPSB）均可减少标本污染，有更好的准确性和可重复性[4,5]。经口或鼻插入者按支气管镜常规检查操作，在插入支气管镜过程中尽可能不作吸引分泌物操作。在经人工气道插入支气管镜采样前，需提前充分给氧，呼吸机支持患者亦可使用三通管，在采样过程之中维持呼吸机使用。将支气管镜引导至影像学定位的病变部位后（宜选择浸润病灶最明显或有脓性分泌物的区域），依次推出套管及毛刷，刷取病变部位分泌物后，将毛刷退入套管后拔出套管。用75%医用乙醇擦拭消毒套管外壁和尖端后，将毛刷伸出，浸入含有1ml无菌生理盐水试管中，充分振荡后，无菌密封试管送培养。 BPSB可用于已建立人工气道的患者，目前多应用在呼吸机相关性肺炎的病原学诊断，有文献提示气管镜引导下PSB和BPSB诊断效力无显著差异[4]。操作上经气管插管或套管缓慢插入，需掌握合适的插入深度（经鼻、口气管插管者约30～50cm，气管切开者约20～40cm），在遇到阻力无法深入时，伸出毛刷刷取分泌物，缩回毛刷后退出。其后操作及标本处理同前。 1.4支气管肺泡灌洗液获取和处理 支气管肺泡灌洗液（BALF）镜检和培养是诊断肺部感染性疾病最可靠的方法，文献显示在确诊和临床诊断侵袭性肺真菌病患者中BALF直接镜检阳性率30.9%，培养阳性率27.4%[6]。我国《支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范（草案）》中要求：①灌洗部位：弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶（B1或B5）或左肺舌段，局限性肺病变则在相应支气管肺段进行灌洗。②操作步骤：在要灌洗肺段，经活检孔通过硅胶管注入2%利多卡因1～2ml局部麻醉，将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处，快速注入37℃灭菌生理盐水，每次25～50ml，总量100～250ml，立即用50～100mmHg负压吸引回收灌洗液，通常回收率在40%～60%。回收液体立即用双层无菌纱布过滤去除黏液，记录总量后装入无菌容器中，冰上低温送检。③合格标准：BALF中无大气道分泌物混入；回收率＞40%，存活细胞占95%以上；红细胞＜10%（除外创伤/出血因素），上皮细胞＜3～5%，涂片细胞形态完整，无变形，分布均匀。 在建立人工气道尤其是呼吸机支持治疗的重症患者，推荐采用低侵入性的盲法微量支气管灌洗术（blinded mini-bronchial lavage，BMBL）。操作时预先给予患者吸入纯氧1分钟，取无菌吸引管，经人工气道置管，缓慢送至支气管崁顿后，注入无菌生理盐水20～30ml，确保回收量在3ml以上[7]。标本经离心后取沉淀涂片观察或培养。 1.5尿标本留取和处理 尿液镜检和培养在侵袭性真菌感染中价值有限，但如发现念珠菌属或马内菲青霉具有一定诊断价值[8]。标本采集应力争在使用抗生素之前，清洁中段尿宜在早晨留取，使用惰性材料制成的广口无菌容器收集，加盖封闭保存。留置导尿管收集尿液，应先消毒导尿管外部，按无菌操作方法使用注射器穿刺导尿管吸取尿液，忌从尿液收集袋中采集尿液[9]。尿液标本室温下保存不超过2小时，4℃保存时间不超过8小时。尿沉渣涂片镜检时，可取5～10ml标本3000～4000r/min离心30分钟后，取沉渣涂片直接镜检或行相关染色后镜检。尿液培养可用接种环涂抹于相应培养基上，取离心后尿沉渣培养可以提高阳性率，培养18～24小时无菌生长时，应继续培养24小时后再观察。 1.6血液 血培养检测病原菌是侵袭性真菌病诊断中的重要依据之一。其操作与常规细菌培养血标本采集相同，要注意无菌原则，在应用抗真菌药物前采血更佳，应采取不同部位的双份血进行培养；如果有留置血管内导管，至少应包括经导管采集的血标本；同时拔除导管者，应将导管尖同步送培养。 1.7胸水 36%侵袭性真菌病患者可能出现胸腔积液[6]，但胸水培养阳性患者并不多见，作为无菌腔液，其阳性有确诊价值。胸水标本需离心后取沉淀直接涂片镜检或接种培养。 2.临床标本阳性解读 2.1念珠菌 念珠菌临床标本分离率高，20%～55%的正常人痰中可以分离出念珠菌，且气道内定植常见，痰念珠菌培养阳性难以区分定植抑或感染，故临床意义有限，其阳性结果解释须慎重，即使经支气管镜下保护性毛刷刷检标本的培养阳性也不能作为诊断侵袭性念珠菌感染的依据。临床研究显示患者痰和BALF念珠菌培养阳性，在未采取任何抗真菌治疗条件下，患者没有发生系统性感染，死亡率无增高[10,11]。尽管有观点认为，多次痰培养阳性可以帮助除外念珠菌污染和定植的可能，但当前国内外指南均没有将气道标本念珠菌培养阳性作为诊断的微生物学依据，也不推荐以此为依据的抗真菌治疗[12]。 相对于培养，气道标本直接镜检的价值更大。念珠菌属于酵母样真菌，在定植状态时，生长缓慢，数量少且多为孢子形态存在。当镜检发现念珠菌形成假菌丝（芽生孢子），并在一定条件下转化为真菌丝，即可能成为感染的状态。所以在合格痰标本、诱导痰或BALF中，直接镜检发现大量出芽菌体和念珠菌菌丝，说明其繁殖迅速可能处于致病状态。 念珠菌定植是发生侵袭性感染的先决条件，重症患者多部位念珠菌定植是发生侵袭性念珠菌感染的独立危险因素[13]。定植指数（colonization index，CI）和校正定植指数（corrected colonization index，CCI）运用临床标本的定量培养技术，帮助判断患者念珠菌定植负荷，能够指导临床对高危人群的早期发现和抢先治疗。其判断标准如下，采集患者气道吸出物（痰）、咽拭子、胃液、尿和直肠拭子（粪便）5个部位的标本进行念珠菌半定量计数。咽/直肠拭子念珠菌计数≥1×102菌落形成单位（colony forming unit，CFU）/ml，胃液、气道吸出物和尿念珠菌计数≥1×105CFU/ml定义为阳性。CCI=阳性部位总数／总标本数。目前认为在高危人群中，CCI≥0.4的脓毒症患者可早期给予抗念珠菌治疗[13]。研究发现定植指数达到阈值比念珠菌感染发生平均提早6天，具有较高临床预测价值，临床据此进行念珠菌抢先治疗，可以使侵袭性念珠菌感染的发生率明显下降却不增加耐药率[14]。 因此，临床上不能仅仅根据痰培养结果进行抗念珠菌治疗，需要参考当时患者的临床高危因素（尤其是粘膜屏障的破坏、原有念珠菌定植、免疫功能抑制等）、相应的临床症状和影像学改变、痰或气道分泌物涂片检查结果（如有无假菌丝或菌丝，出芽孢子等）、定植指数（尤其是校正定植指数），再结合血清标志物（如G试验）检测结果等来判定其临床价值，再决定是否需要进行经验性治疗。如果血培养念珠菌阳性的患者，同时出现呼吸道感染的证据，胸部影像学出现新的病变又不能用细菌感染等其他原因解释，此时痰培养多次阳性并与血培养的结果相一致，可以作为继发性肺部念珠菌感染的微生物学依据。 无菌腔液（血液和胸水）念珠菌培养阳性是确诊侵袭性念珠菌感染的微生物学重要依据。 怀疑泌尿系统念珠菌感染时，可行尿沉渣涂片镜检。在没有置入导尿管的患者如果尿标本念珠菌培养两次以上阳性可作为诊断的微生物学依据；在置入导尿管的患者，尿标本培养阳性不能作为微生物学诊断依据。尿标本培养阳性的解读必须结合临床，如果无任何临床症状，则念珠菌尿症一般不推荐治疗，除非患者处于念珠菌播散的高风险环境；诱发因素去除后通常能解决念珠菌尿症。但对于有症状的念珠菌尿症，或念珠菌尿症患者怀疑发生播散性念珠菌病时，应进行治疗，方案等同于念珠菌血症。 近年来，非白念感染的比例不断升高[15]。上世纪末法国CHROMagar公司开发出念珠菌显色培养基，实现了一步培养直接鉴定白色念珠菌（蓝绿色）、热带念珠菌（蓝色）、克柔念珠菌（粉红色）、光滑念珠菌（粉红色）和近平滑念珠菌（浅白色）等常见的念珠菌属病原体。这种方法为临床早期种属判断提供了条件，为早期治疗的药物选择提供了参考依据。 免疫荧光染色法主要有以下优势： 染色原理为染色液与真菌细胞壁几丁质的特异性结合，可以排除检测中其他物质的干扰； 检测的灵敏度更高，可以增加阳性的检出率，降低漏检率。 暗视野的荧光观察使镜下的菌丝、孢子结构更加清晰，易于辨认。 2.2曲霉 曲霉孢子直径2～5μm，易在空气中悬浮，吸人孢子后可引起曲霉病，多见于肺和鼻窦感染，在气道标本中常可以检出，由于存在污染和定植可能，其结果解读需慎重。 临床标本涂片镜检时，标本可用10%氢氧化钾预处理，去除蛋白成分的同时保证菌丝的完整性，并更易观察。为了进一步提高镜检的敏感性，可选择多种染色方法，染色后在显微镜下观察到细长、锐角二分叉的分隔菌丝可证实为曲霉菌丝。HE染色时真菌孢子和菌丝的细胞壁着浅红色，能够提高曲霉菌丝的识别率，但由于与背景颜色一致，在菌量少、只存在菌丝碎片或者分布有大量坏死组织时，检出率将明显下降。特异性染色中，GMS染色是在染色剂与真菌细胞壁中的多糖结合后，通过真菌细胞壁内所含的醛基把六胺银还原为黑色的金属银，使菌丝显黑色。PAS染色菌丝着红色，同时细胞成分和结构做为背景也以紫红色显示出来，临床上可以联合GMS染色和PAS 染色，提高曲霉菌丝检出率[1]。 曲霉属适合在标准培养液中生长，多数实验室能够鉴别菌种。以菌落形态和分生孢子头的颜色进行群的划分，然后以分生孢子的形态和颜色、产孢结构的数目、顶囊的形态以及有性孢子的形态等进行种的鉴定。 临床气道标本曲霉分离率不高，曲霉培养的敏感度和特异度有限[12]，而在BALF中曲霉培养阳性率小于15%[16]。2008年美国感染病学会曲霉病诊治临床实践指南提出：气道内标本如合格痰标本、气管内吸引物、BALF或刷检标本镜检发现菌丝，痰标本培养连续2次分离到同种曲霉及BALF的单次培养阳性，可作为诊断肺曲霉病的微生物学依据[17]。但临床医师依然应注意须将结果与宿主因素和临床特征相结合来判定其临床意义。 曲霉病患者血培养阳性少见，即使发生全身性感染，曲霉血培养阳性率仍较低，所以血培养曲霉阳性必须排除是否为外源性污染所致，结果解读应慎重。胸水培养获得阳性结果可作为确诊依据，但在临床并不多见。值得注意的是，如在标本采集前患者曾接受全身抗真菌治疗，微生物学检查阴性不能排除侵袭性曲霉感染的可能性。 2.3隐球菌 隐球菌感染以新生隐球菌最常见，检测的常用染色方法包括HE染色法、墨汁染色法、PAS染色法、阿尔辛蓝染色法和GMS染色法等。HE和GMS染色易发现隐球菌，但可能会与念珠菌或组织胞浆菌混淆。墨汁染色通常用于检查脑脊液或分泌物涂片中的隐球菌，阳性率大约为60%，具有方便、快速、节约成本等优点，是涂片中检查隐球菌感染的首选方法，该方法不适合在粘稠的呼吸道分泌物中应用。阿尔辛蓝法常用于鉴别新生隐球菌，由于新生隐球菌夹膜属于黏液物质，可被阿尔辛蓝和胭脂红着色，而其他真菌和荚膜无着色，因此阿尔辛蓝染色法对新生隐球菌相对特异，能将新生隐球菌和与其形态、大小相似的酵母鉴别开来。染色后见有圆形或椭圆形的菌体，其外有宽厚的荚膜即可做出诊断。 隐球菌脑脊液培养应采集3~5ml以上标本送检[18]。隐球菌分离培养用沙保培养基于30℃左右培养最为适宜，2到5天即可形成典型的隐球菌菌落，取菌镜检，可见到圆形或椭圆形菌体，无假菌丝形成。 在隐球菌病患者临床气道标本中，痰培养和涂片阳性率一般低于25%。由于新生隐球菌可以寄居于正常人群，因此痰液甚至气管吸引物培养出现新生隐球菌，应根据临床具体情况进行判断是否有肺隐球菌感染。通常健康人气道内无隐球菌存在，而慢性结构性肺疾病患者有可能存在定植[19]。值得关注的是，免疫功能异常的肺隐球菌感染者易出现全身播散，尤以中枢神经系统多见，若此类患者以手术病理明确诊断或经手术治疗，肺外播散的可能性更大。因此，对怀疑脑膜炎者应尽早进行脑脊液检查，脑膜炎早期脑脊液涂片阳性率可达85%以上，而且培养的阳性率也较高。目前对确诊为肺隐球菌病的患者是否需要常规行脑脊液检查尚无定论，但对免疫功能异常患者建议行脑脊液检查[20]。 2.4肺孢子菌 肺孢子菌肺炎（PCP）是机会致病性病原体伊氏肺孢子菌所致的肺部感染。肺孢子菌有两种致病形态，即包囊与滋养体，是艾滋病患者的主要致死原因之一。虽然PCP病死率较高，但早期诊断并及时治疗70%的患者可治愈。 与其他真菌不同，肺孢子菌无法通过可靠的培养方法检出，所以其感染主要确诊方式是通过多种染色技术直接观察病原体，具有很高的特异性。目前常用于肺孢子菌包囊和滋养体检测的染色方法有GMS染色法，瑞氏-吉姆萨染色法，巴氏染色法（Pap），荧光增白剂染料（CW）染色法。研究显示GMS选择性染色肺孢子菌囊壁，诊断的敏感性为76.9%，但特异性高达99.2%[21]；瑞氏-吉姆萨染色可染病原体的各阶段，适用于涂片镜检；巴氏染色（Pap）可染病原体周围被称作“泡沫体”的嗜酸性物质，是一种敏感性和精确度均可靠的诊断方法[19]。部分无痰患者可经盐水雾化吸入诱导排痰，此法无侵入性亦有很高的敏感性。PCP诊断最可靠的依据是在BALF或诱导痰中直接镜检发现病原体[22]。 3、小结 在侵袭性真菌病诊治过程中，一方面存在对临床标本尤其是气道标本的镜检和培养的忽视和解读不充分，如忽视痰培养阳性结果的意义，片面认定污染和定植等情况，延误了治疗的最佳时机。另一方面也存在高估结果临床价值的倾向，以气道标本培养阳性作为侵袭性真菌病临床诊断的“微生物证据”，从而导致过度治疗。 临床上应避免过分依赖新的微生物抗原检测或分子生物学检测方法，而忽视临床标本镜检和培养。很多时候镜检可能是更为快捷、经济和可信的检测方法。同时，标本真菌镜检和培养，应建立在合格的标本留取方法，规范的标本处理程序上，这样的结果才可能成为临床医生诊断中的有力证据。而在临床解读中，需结合地区性微生物学特征，高危因素，临床表现及其他实验室检测结果做出综合判断。 参考文献 [1] Hope WW，Walsh TJ，Denning DW. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infect Dis，2005，5(10): 609-22. [2] Pirracchio R, Mateo J， L al. Can bacteriological upper airway samples obtained at intensive care unit admission guide empiric antibiotherapy for ventilator-associated pneumonia. Crit Care Med，2009，37(9): 2559-63. [3] 杨肇立，李键，李俊如，等. 呼吸道分泌物真菌半定量培养和直接涂片检查同时进行的临床准确性探讨. 医学检验与临床，2006，17（4）:17-19. [4] 蔡少华, 张进川, 钱桂生. 保护性毛刷盲取技术在呼吸机相关肺炎病原学诊断中的价值. 中华结核和呼吸杂志，2004，(06): 58-60.
来源: 黎明生物
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