直接免疫荧光法测抗原

　　直接免疫荧光技术将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法，这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。

　　一、基本原理

　　将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。

　　二、试剂与仪器

　　1、磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4；

　　2、荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释；

　　3、缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制；

　　4、搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）；

　　5、有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）；

　　6、荧光显微镜；

　　7、玻片架；

　　8、滤纸；

　　9、37℃温箱等。

　　三、实验步骤

　　1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度；

　　2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）；

　　3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不时振荡；

　　4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖；

　　5、立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

　　四、注意事项

　　1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1：20-100之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察；

　　2、染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30min效果好的多；

　　3、为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰：

　　（1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS；

　　（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

　　4、一般标本在高压灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。