ANCA间接免疫荧光法检测真的不需要了吗？

周仁芳 温州医科大学附属温岭医院检验科

黄清水 南昌大学第一附属医院检验科

何敏 广东省中医院检验科

最近有许多国内自身抗体检测的同行给我们打电话咨询：国内一些专家提出临床标本检测中ANCA间接免疫荧光法检测不需要做了，可以用检测抗MPO和抗PR3抗体的ELISA等其他抗原特异性检测方法代替，理由是：2017年修订版肉芽肿性多血管炎（GPA）和显微镜下多血管炎（MPA）患者关于抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）检测的国际共识提出疑似ANCA相关血管炎（AAV）患者（GPA、MPA），使用高质量的抗原特异性免疫学方法检测抗MPO抗体、抗PR3抗体可作为其筛查实验，而不一定使用IIF-ANCA。

这些专家的说法靠谱吗？跟临床实际工作接地气吗？

究竟ANCA间接免疫荧光法检测还需要做吗？是不是可以用检测抗MPO和抗PR3抗体的ELISA等其他检测方法代替？

划重点：

(1) 目前国际上关于ANCA检测的共识主要包括：1999年的《抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)检测和报告的国际共识》【InternationalConsensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil CytoplasmicAntibodies (ANCA)】和2017年的肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎患者ANCAs检测国际共识【Revised 2017 international consensus on testing of ANCAs ingranulomatosis with polyangiitis and microscopic polyangiitis】

(2) 2017年修订版肉芽肿性多血管炎（GPA）和显微镜下多血管炎（MPA）患者关于抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）检测的国际共识，有严格的前提条件：针对特定人群GPA和MPA患者，而不是所有临床需要检测ANCA的患者，并且明确排除了炎症性肠病等需要检测ANCA的患者。所以该共识仅针对GPA和MPA患者中的ANCA检测，并不是指临床所有ANCA检测的共识。

(3) 根据2017年EULAR/ACR的GPA、MPA、EGPA的分类标准，ANCA检测包括抗MPO抗体、抗PR3抗体，或者IIF-ANCA中的pANCA或cANCA。并没否定ANCA间接免疫荧光法检测的临床价值。

(4) 不要简单误解《2017年的肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎患者ANCAs检测国际共识》为ANCAs的实验室检测国际共识，而误导国内ANCA实验室检测的同行。

(5) 目前为止，ANCA间接免疫荧光检测的临床应用价值尚不能被抗MPO抗体，抗PR3抗体等ANCAs靶抗原检测的其他方法代替，ANCA间接免疫荧光检测还将在临床应用中发挥重要作用。

                 甲醛固定的人中性粒细胞           乙醇固定的人中性粒细胞

【背景材料】抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA) 在1982年由Davies等在研究节段性坏死性肾小球肾炎患者血清中的抗核抗体过程中偶然发现，使用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IIF) 在中性粒细胞的实验室基质上，可观察到中性粒细胞胞浆弥散分布的荧光染色，而非细胞核的荧光染色。1985年vander Woude等发现在肉芽肿性多血管炎 (granulomatosis with polyangiitis, GPA) 患者中出现主要为胞浆型ANCA (cytoplasmic ANCA, cANCA)，并对这些自身抗体产生兴趣。1988年Falk和Jennette报道在系统性血管炎和原发性坏死性新月体型肾小球肾炎患者的血清中发现核周型ANCA (perinuclearANCA, pANCA)。随后，研究者使用酶联免疫吸附试验(ELISA)发现髓过氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO)是pANCA的主要靶抗原，蛋白酶3 (proteinase 3, PR3)确认为GPA的cANCA的主要靶抗原。随着临床上对ANCA的不断认识和深入研究，ANCA也被发现与其他小血管炎相关，如显微镜下多血管炎 (microscopic polyangiitis, MPA)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎 (eosinophilicgranulomatosis with polyangiitis, EGPA)等。

ANCA作为小血管炎的实验室标志，主要存在于ANCA相关血管炎（ANCA-associated vasculitis, AAV）患者中，特别是GPA和MPA。根据1999年ANCA检测的国际共识[1]，IIF作为ANCA检测的筛查实验，IIF-ANCA阳性后再进行其特异性抗体的检测，如抗MPO抗体、抗PR3抗体。对临床疑似AAV患者，建议IIF-ANCA联合抗MPO抗体、抗PR3抗体检测，可提高对AAV的临床诊断性能。在过去的10多年里，随着生物技术的不断进步，抗MPO抗体、抗PR3抗体的检测技术也在不断发展，从最初的ELISA发展到更加灵敏、自动化的检测新技术，如荧光酶免疫法（FEIA）、化学发光法（CLIA）、多重流式免疫法（MFIA）等。ELISA检测技术本身也发生了技术革新，从最初的抗原直接固相载体的间接法发展到第二代（捕获法）、第三代（锚定法）检测方法。随着上述抗MPO抗体、抗PR3抗体检测新技术的应用，IIF-ANCA作为ANCA筛查实验的最佳方法也引起了疑问。对此欧洲血管炎研究组（EUVAS）开展了ANCA检测的IIF和特异性抗体免疫学方法的多中心研究[2]。在上述多中心研究基础上，于2017年发布了修改版的ANCA检测国际共识[3]，提出疑似AAV患者（GPA、MPA），使用高质量的抗原特异性免疫学方法检测抗MPO抗体、抗PR3抗体可作为其筛查实验，而不一定使用IIF-ANCA。

【2017版国际共识中的6条建议】

1.建议按照ANCA检测策略的推荐方法，选择ANCA检测应该遵守国际共识中建议的临床指南。（为确保ANCA检测以支持AAV的诊断，有以下临床表现的患者应进行ANCA检查。如肾小球肾炎，特别是快速进展的肾小球肾炎；肺出血，特别是肺-肾综合征；有系统特征的皮肤型血管炎；多个肺结节；上呼吸道慢性破坏性疾病；长期鼻窦炎或耳炎；声门下气管狭窄；多发性单神经炎或其他周围神经病变；眶后肿块；巩膜炎。）

2.高质量的抗原特异性免疫学方法检测抗MPO抗体、抗PR3抗体，应该被当作ANCA的筛查试验。

3.若抗MPO抗体、抗PR3抗体检测结果均阴性，但临床仍高度怀疑小血管炎，应使用其他免疫学方法和/或IIF再次检测，或者推荐到有经验的实验室进行检测。弱阳性结果使用其他方法或IIF检测时，可适当增加方法学的特异性。

4.抗MPO抗体、抗PR3抗体检测结果阴性，不能排除AAV的诊断。

5.抗MPO抗体、抗PR3抗体检测结果阳性，有助于诊断AAV，但不能仅凭此结果进行确诊。

6.根据抗体水平有助于临床解释。

【共识的应用注意事项】

1.ANCA可见于ANCA相关血管炎（GPA、MPA、EGPA）、胃肠道疾病（炎症性肠病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、慢性病毒性肝炎等）、系统性炎症（系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等）、恶性疾病（非霍奇金淋巴瘤、骨髓增生异常等）、感染性疾病（细菌性心内膜炎、结核感染等）及药物诱发的AAV（肼苯达嗪、丙基硫氧嘧啶、二甲胺四环素等）。但本国际共识仅适用于GPA和MPA患者中的ANCA检测。

2.本共识主要基于2016年欧洲血管炎研究组（EUVAS）开展的ANCA检测IIF和抗原特异性免疫学方法的多中心研究，入选的病例考虑到ANCA在治疗过程中的影响和EGPA的异质性，仅选择初诊的GPA和MPA患者。明确强调了该共识排除了IBD等临床诊疗需要检测ANCA的患者。

3.根据2017年EULAR/ACR的GPA、MPA、EGPA的分类标准，ANCA检测包括抗MPO抗体、抗PR3抗体，或者IIF-ANCA 中的pANCA或cANCA。

4.本共识中高质量的抗原特异性免疫学方法检测抗MPO抗体、抗PR3抗体，主要包括第二、三代ELISA，化学发光法（CLIA）、荧光酶免疫法（FEIA）及免疫微球法等。但国内实验仍存在使用第一代ELISA检测抗MPO抗体、抗PR3抗体。

综上述，本国际共识目的在于帮助GPA和MPA的诊断，以及ANCA检测和解释的标准化。切忌无视本共识规定的对GPA和MPA患者诊断应用前提，扩大推论得出ANCA临床检测不需要做IIF-ANCA的错误结论。

参考文献

[1] J.Savige，D. Gillis，E. Benson，等. International Consensus Statement onTesting and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA)[J]. Am JClin Pathol, 1999, 111(4): 507-13.

[2] J.Damoiseaux，I. Heijnen，C. Van Campenhout，等. An international survey onanti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) testing in daily clinicalpractice[J]. Clin Chem Lab Med, 2017,

[3] X.Bossuyt，J. W. Cohen Tervaert，Y. Arimura，等. Position paper: Revised 2017international consensus on testing of ANCAs in granulomatosis with polyangiitisand microscopic polyangiitis[J]. Nat Rev Rheumatol, 2017, 13(11): 683-692.