CNAS发布微生物检测方法验证与确认指南（上）

近日，CNAS发布了《合格评定—微生物检测方法验证与确认指南》（征求意见稿），全文如下。

一、范围

本标准规定了实验室对微生物检测方法进行方法确认和方法验证的一般性原则。本标准适用于实验室对非标准方法、实验室制定的方法，超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法的方法确认，以及实验室对新引入标准方法正式使用前的方法验证。

二、方法确认要求

（一）总则

实验室应对非标准方法、实验室制定的方法、超出预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法的确认制定程序。确认应尽可能全面，以满足预期用途或应用领域的需要。对于确定过的方法，实验室应制定作业指导书。实验室应按照技术方案先进行实验室内确认研究试验，然后，由协作实验室用相同的样品进行实验室间协同试验。可采用对待确认方法与基准方法进行比较研究的方式，对待确认方法的性能参数进行确认。

（二）确认方法的特性参数

实验室可在综合考虑成本、风险和技术可行性基础上，并根据预期的用途来进行方法确认。实验室进行方法确认的内容应完整，包括但不限于以下方法特性：

• 方法的适用范围；

• 检测水平和/或定量限；

• 精密度（重复性和/或再现性）；

• 正确度；

• 准确度；

• 灵敏度；

• 包容性和排他性；

• 结果的测量不确定度。

确认方法特性参数的选择

方法确认首先应明确检测对象特定的需求，包括样品的特征，数量等，并应满足客户的特殊需要，同时应根据方法的预期用途，选择需要确认的方法特性参数，典型的需要确认的方法特性参数见表1。

表1 典型方法确认参数的选择

（三）方法特性参数的确认

实验室内方法特性参数的确认

灵敏度

灵敏度是基准方法或待确认方法从含有众多微生物的样本中检测到目标微生物的能力，目的是确定基准方法和待确认方法之间的灵敏度差异。灵敏度试验的样品选择自然和/或人为污染的样品。每个食品种类至少有3种食品类型组成，每个食品类型至少测试20个样品。

比较待确认方法与基准方法的成对结果，两个方法的阳性结果一致则为阳性符合（PA），两个方法阴性结果一致则为阴性符合（NA）。待确认方法检出阳性结果，而基准方法为阴性结果，则为阳性偏离（PD）；待确认方法检出阴性结果，而基准方法为阳性结果，则为阴性偏离（ND）。分别计算待确认方法（SEalt）和基准方法（SEref）的灵敏度，待确认方法的相对正确度（RT）和假阳性率。

其中N是样本总数（NA + PA + PD + ND），FP是假阳性结果。

配对和非配对研究的阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之差（ND - PD），配对研究的阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之和（ND + PD），用于可接受性限（AL）的评估。方法确认研究的可接受性限（AL）可参考附录A的表A.1。当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当AL不满足时，应对根本原因进行分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认方法是否不适用于所分析的食品种类或类别。

三、相对检测水平

检测水平（LODx）是预期可以检测到目标微生物的最低含量。在本标准中，使用LOD50，即在一定的污染水平期望获得50%的阳性结果。对待确认方法和基准方法的检测水平（LOD）进行比较研究，并采用相对检测水平（RLOD）对待确认方法进行评估。相对检测水平的研究采用人工污染样品的方式，在三种或更多的污染水平下进行。

RLOD定义为待确认方法和基准法的检测水平（LOD）的比率，计算如式（5）：

配对研究的可接收性限（AL）为1.5，即待确认方法的LOD不得高于参考方法的LOD的1.5倍。未配对研究的AL设定为2.5，即待确认方法的LOD不得高于参考方法的LOD的2.5倍。待确认方法的LOD值小于基准方法的LOD值是可接受的，表明待确认方法比基准方法可能检测到更低的污染水平。

当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当AL不满足时，应对根本原因进行分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认方法是否不适用于所分析的食品种类或类别。

四、包容性和排他性

包容性和排他性所使用的每株菌株应具有足够详细的生物化学和/或血清学和/或遗传学特征。对于定量方法，包容性和排他性测试适用于特定微生物的计数（例如，李斯特氏菌），不适用于计数所有微生物总数的方法，例如菌落总数、霉菌和酵母计数等。对于包容性测试，应测试至少50个（目标）微生物纯培养物。对于排他性测试，应测试至少30个（非目标）微生物的纯培养物。

包容性

只需要使用待确认方法进行包容性测试，在测试过程中不需要添加样品。测试菌株的纯培养应是最佳生长条件下，非选择性培养基上培养并处于稳定期的细胞群体。接种水平应比已确认方法的最低检测水平高10倍至100倍。当包容性结果为阴性或可疑时，应同时用基准方法进行重复测试，分析相关菌株是否可以用基准方法进行检测。

排他性

只需要使用待确认方法进行排他性测试，在测试过程中不需要添加样品。测试菌株的纯培养应是最佳生长条件下，非选择性培养基上培养并处于稳定期的细胞群体。如果待确认方法具有在选择性培养基中增菌的步骤，为了排他性测试的目的，选择性培养基应由非选择性培养基替代。当排他性结果为阳性或可疑时，应对待确认方法的完整测试方案进行重复测试，同时用基准方法进行测试，确认基准方法不能够检测出相关菌株。