病原宏基因组测序在新型冠状病毒检测中的应用与挑战

一、mNGS的原理、流程及其临床应用进展

mNGS是一种基于二代测序技术的无需培养、无偏好性的病原检测技术，通过对临床样本中直接提取的DNA和/或RNA进行高通量测序，再经过数据库比对与生物信息学分析，可一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测。mNGS的检测流程可以大致分为5个步骤：核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析与报告解读。对于不同的临床样本，核酸提取前需要进行不同的前处理，比如痰液液化、破壁、去宿主等以提高病原体检出率。文库构建的目的在于给未知序列的核酸片段两端加上已知序列信息的接头以便于测序，单样本文库构建完成后需要经历PCR扩增、再将多个文库样本混合后进行测序。测序完成后，数据会自动进入搭建好的病原体自动分析流程，该流程包括去除人源宿主序列和低质量序列、以及微生物数据库比对注释等步骤。最后，解读专家根据自动化系统产生的初步结果，再结合部分临床指标、样本类型、病原体种类等因素进行综合分析解读。

2014年新英格兰医学杂志发表mNGS确诊钩体病的首例临床应用案例^[3]， 5年来，mNGS在新发病原体鉴定、罕见重要病原体诊断和临床大数据研究等方面取得诸多进展。在国内，利用mNGS发现新发病原体的开创性工作来自于复旦大学附属华山医院感染科与中国医学科学院北京协和医院神经科：2018年，艾静文等^[4,5]先后报道了感染猪的病原体猪疱疹病毒可跨物种传播，并导致人发生眼内炎、中枢神经系统感染的案例。近年，mNGS在罕见重要病原体诊断的临床应用案例也不断增加，我国已有数十篇报道，涉及布鲁氏菌、单核增生李斯特菌、脑囊虫、人类疱疹病毒、恙虫病、阿米巴原虫、曼氏裂头蚴等诸多罕见重要病原体引起的重症感染^{[6,7,8,9,10,11,12]}。随着技术发展与临床应用推广，针对mNGS与不同方法学之间的比较和临床应用的大样本数据文章也在涌现^[13,14,15]，这些大样本数据的研究结果均肯定了mNGS的临床应用价值。也因此，在2018年和2019年，mNGS用于病原学诊断被先后写入《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南》与《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》^[16,17]。

二、mNGS在新型冠状病毒检测中的优势

1．对新型冠状病毒的迅速鉴定：

2019年底，mNGS凭借其在新发病原体检测方面的优势，在新型冠状病毒肺炎疫情中发挥了重要作用，成为此次疫情病原体快速鉴定的关键环节。相较于2003年SARS鉴定耗时5月余^[18]、2013年H7N9鉴定耗时1月余^[19]，新型冠状病毒的基因组鉴定和分析在五天内即完成。2020年1月29日，任丽丽等^[20]在《Chinese Medical Journal》发表的描述性研究还原了新型冠状病毒发现和鉴定的始末：研究者收集了湖北省武汉市金银潭医院5例重症肺炎患者的临床资料和支气管肺泡灌洗液样本，提取样本中的RNA核酸后进行了mNGS检测与进化分析。结果显示5份标本中均发现了一个前所未知、与SARS病毒核苷酸序列相似度79%、与蝙蝠来源毒株最接近、但形成单独进化分支的新的冠状病毒β属毒株序列。基于基因序列信息，研究者们继续开展病毒分离并进行形态确认与血清学检测，最终确认了该冠状病毒为一种新发病原体，即新型冠状病毒。同期，Chen等^[21]也报道了通过mNGS在两例肺炎病例的肺泡灌洗液中检测出高序列的未知病毒并进行了序列拼接、同源性以及SNP分析，指出理论上mNGS虽覆盖样本中的所有微生物组，但两例样本中病毒滴度非常高，除新型冠状病毒外并未发现其他疑似感染的病原体，而且SNP分析表明两例患者感染的新型冠状病毒几乎相同，提示两例患者不同时间段感染同一冠状病毒。这些新型冠状病毒的早期发现和迅速鉴定为本次疫情感染病原体的进一步确认以及防控争取了时间，为后续该疾病的临床诊断和治疗提供了明确的方向。

2．序列深入分析：

从方法学层面来说，mNGS与RT-PCR具有显著不同。现有RT-PCR试剂主要靶向新型冠状病毒的ORF1ab与N基因等，而mNGS除RT-PCR的靶标外，也覆盖新型冠状病毒基因组的其他区域，一方面可以防止因RT-PCR靶标区域突变导致的"假阴性"，另一方面也有助于获得更多的序列信息，甚至组装出全基因组序列信息用于溯源进化分析、帮助预测病毒的传播模式、发现和分析突变位点等。

3．对其他病原及混合感染的综合鉴定：

冬春季节是肺炎尤其是病毒性肺炎的高发时期，来自湖北或有接触史的患者可首要考虑新型冠状病毒肺炎，然而没有明确流行病史的患者不排除其他病原体感染的可能。对于此类感染患者，其病毒性肺炎的真正致病病原体需要鉴别诊断。另一方面，即使是新型冠状病毒确诊患者，仍不能排除其他病原体混合感染的可能，混合感染在肺炎患者中占有较大比例且可能加重该类肺炎患者的治疗难度，最终影响患者的预后。2月1日，菲律宾报道了首例中国境外的新型冠状病毒死亡病例，除新型冠状病毒以外，该患者还检出多种其他病原体，包括肺炎链球菌和乙型流感病毒^[22]。因此在现阶段，mNGS可同时检测多种病原的特点使其在新型冠状病毒感染疑似病例的鉴别诊断和确诊患者的混合感染诊断中发挥了重要作用。

三、mNGS在新型冠状病毒检测中的挑战

尽管mNGS在鉴定新发病原体、鉴定混合感染等方面具有天然优势，但由于其方法学的特点，作为新型冠状病毒一线筛查的诊断方法还存在一些不足。

1．检测周期较长：

现阶段mNGS的检测模式主要由各临床单位外送至第三方检测机构，少数医院通过自建、共建实验室等方式也实现了院内检测，但是mNGS方法学流程就决定了其最快检测周期为24 h，平均检测周期约48 h或更长，相较于RT-PCR平均3～5 h的检测周期，mNGS在新型冠状病毒的快速筛查上不具备优势。

2．流程复杂且标准化欠缺：

与RT-PCR相比，mNGS的实验过程更加复杂，其核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析和报告解读这五个步骤所涉及的仪器和试剂众多，对检测人员和数据分析人员的资质要求也更高。另外，现阶段国内权威机构尚未颁布mNGS临床应用指导原则与标准化操作流程。差异化的质控流程、前处理/核酸提取方式、建库方式、测序平台、生信分析流程及解读规则导致国内现阶段各厂家的mNGS流程"百花齐放"，也使得大部分临床单位并不具备开展mNGS检测的能力。因此，mNGS很难实现基层医院的院内检测，并不适合作为新型冠状病毒的大规模筛查方法。

3．时间和成本控制下的部分样本测序深度不足：

尽管从方法学上来说，二代测序可以提供足够的测序深度，但是mNGS的常规临床应用还需要考量检出时间和成本等因素。在有效去除人源宿主的情况下，mNGS可以在24 h内单流程产出5×10⁶~24×10⁶数据量（1 000万~2 400万条测序序列）以满足疑难、危重、特殊感染患者的病原体鉴定需求^[23,24]。对于病毒而言，不同区域的特异性检测序列数只要达到3条即可实现准确鉴定^[23]；对于部分病毒载量高的样本，甚至可以将测序得到的大量核苷酸片段进行拼接，从而获得目标病原体的全基因组片段进行进化与突变分析。但是对于部分病原体载量较低的样本，上述测序深度可能不足以实现病原体的准确鉴定。增加测序深度是提高检出率与比对准确度的可选方案，但同时也意味着检测成本的升高和检测时间的延长。如何平衡测序数据量与检测成本和检测时间是部分病原体低载量样本必须要考量的因素。

综上，mNGS与RT-PCR这两种新型冠状病毒的核酸检测方法具有较强的优势互补特点，在临床上的应用需综合考虑：RT-PCR由于其检测速度快、操作流程简单、成本较低的原因，更适用于大规模的筛查中，以便快速获得是否为新型冠状病毒核酸阳性的初步证据，而对于RT-PCR检测阴性、但临床表型高度疑似的患者，利用mNGS进一步确认可有效提高检测结果的可靠性，并获得是否有其他病原体感染的信息；此外，对于RT-PCR检测阳性的样本，也可以进一步利用mNGS进行病毒全序列的分析，从而帮助获得病毒是否发生变异的信息，为疫苗、药物研发等方面提供可靠证据。然而迄今为止，尚未有mNGS检测新型冠状病毒方面的临床大样本研究成果，这对于mNGS来说既是挑战也是机遇。未来，随着mNGS自动化程度的提高（如实现核酸提取自动化、建库自动化）以及检测成本的进一步降低，mNGS的临床应用将会更加成熟，在病原体核酸检测中也将发挥更重要的作用。