【专家论坛】尿白蛋白检测方法及标准化研究的新进展

一、u-ALB的检测方法

尿常规检查使用的试纸条法是u-ALB检测常用方法，但该方法属于半定量/定性检测方法，检测下限在150~200 mg/L^[2]，不适用于慢性肾脏病的早期发现。本文主要讨论u-ALB的定量检测方法，包括免疫分析法、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和质谱法。

（一）免疫分析法和HPLC

u-ALB检测利用免疫分析原理的方法包括：放免法（Radio-Immunoassay，RIA）、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、酶联免疫吸附分析、化学发光免疫分析等。免疫比浊法是临床使用最多的u-ALB检测方法。2019年国家卫生健康委临床检验中心组织的尿液定量生化室间质评（External Quality Assessment，EQA）数据显示免疫散射比浊法和免疫透射比浊法是我国u-ALB检测的主要方法，分别占总体参加用户的27.6%（151/548）、67.5%（370/548），涉及至少44种体外诊断试剂。目前市售u-ALB诊断产品的检测下限可以达到2~3 mg/L。

HPLC检测u-ALB的基本原理是分子排阻，即利用不同蛋白分子量不同的性质分离待测蛋白进行定量测量。HPLC检测u-ALB结果比RIA或其他免疫分析方法结果高的现象引发了一些争议，造成结果偏高的因素可能不仅是因为尿液中存在非免疫反应性白蛋白，还可能与HPLC法的分析性能有关。利用分子排阻法在色谱上洗脱白蛋白时，洗脱峰中可能包含相对分子质量（M_r）在40 000~80 000的其他蛋白质，如转铁蛋白、α₁酸性糖蛋白和α₁蛋白酶抑制剂，造成结果偏高^[11]。另外，白蛋白与单体IgG、α₁微球蛋白等蛋白的色谱峰可能存在交叉，也会使HPLC结果偏高^[11]。一项对质谱法与HPLC法的比对结果显示：HPLC法比质谱法高了约38%^[12]

Sviridov等^[13]为探讨尿液中多种形式的白蛋白对免疫分析法的影响，设计使用溴化氰（CNBr）、胰蛋白酶、抗坏血酸、过氧化氢（H₂O₂）等多种物质处理白蛋白，模拟尿中可能存在的白蛋白形式，比较两种不同免疫反应原理的方法受影响的情况。两种免疫分析方法分别是使用多抗血清的免疫比浊法（美国Beckman LX20）和使用单克隆抗体的竞争性免疫分析法（德国Siemens Immulite）。使用多抗血清的LX20几乎能识别经各种处理的白蛋白和白蛋白片段，只有经胰蛋白酶解的白蛋白片段不具反应性；使用单抗的Immulite方法对于经CNBr处理的白蛋白片段几乎没有交叉反应。Babic等^[12]研究中值得一提的是经抗坏血酸孵育，白蛋白产生部分裂解但仍然经二硫键连接，即模拟了Comper所提的"非免疫反应性白蛋白"。LX20和Immulite分别能保留98%和78%的反应性，即使在更极端的条件下Immulite只有2%的反应性而LX20仍有65%的反应性。这说明非免疫反应性白蛋白的存在确实会造成部分免疫分析法结果偏低，特别是使用单抗原理的免疫方法。但多抗原理的免疫方法几乎不受干扰，这一点与HPLC法所提出的无法检出是矛盾的。

总体来说，HPLC法受限于自身的方法学局限性还不能替代免疫分析方法检测u-ALB，而免疫分析法在开发和设计时需要考虑抗体的性质，目前IFCC WG-SAU首选基于多抗血清的免疫分析法定量u-ALB^[14]。

（二）质谱法

1．同位素稀释液相色谱质谱法（Isotope Dilution Liquid Chromatography Mass Spectrometry，ID LC-MS）：

Ravinder Singh团队^[15]在前期研究^[12]的基础上，利用毕赤酵母（Pichia pastoris）合成¹⁵N标记的人血清白蛋白（纯度为98.95%）作为内标，检测未标记的b₂₄⁴⁺（m/z=685.1）、b₂₄³⁺（m/z=693.6）和¹⁵N标记的¹⁵N-b₂₄⁴⁺（m/z=913.2）、¹⁵N-b₂₄³⁺（m/z=924.1），定量限为10.5 mg/L。检测限为4.84 mg/L，重复性为4.0%~12.6%，日间变异为7.1%~12.2%，校准范围为4~625 mg/L。

2．同位素稀释液相色谱串联质谱法（Isotope Dilution Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，ID LC-MS/MS）：

（1）Mayo Clinic的方法：Rajiv Kumar团队^[16]建立了以蛋白水解为基础的LC-MS/MS法是首个使用全长纯化的重组¹⁵N标记的人白蛋白（¹⁵NrHSA）作为内标的方法。样本和内标经胰蛋白酶酶解和色谱分离后，同时检测C末端和N末端3个肽段，分别为⁴²LVNEVTEFAK⁵¹、⁵²⁶QTALVELVK⁵³⁴和¹³DLGEENFK^20[17]。方法重复性为1.9%~12.3%，日间变异为6.4%~14.1%，校准范围为3.13~200 mg/L。该方法有待专家实验室进行验证，可望成为u-ALB候选参考方法。（2）NIST的方法：NIST在Rajiv Kumar等^[16]的研究基础上，同时检测经胰蛋白酶酶解后分布在白蛋白各个部位的11个肽段（图1），其中HSA_1、HSA_2和HSA_14是Rajiv Kumar方法检测的3个肽段，其余8个是NIST方法新增肽段，每个肽段对应两个子离子^[6]。该方法的定量限约为5.3 mg/L，检测范围约为5~300 mg/L。Ashley Beasley-Green认为该方法能绝对定量完整的尿白蛋白，可作为u-ALB候选参考方法^[6]。

二、u-ALB检测的现状

当前u-ALB检测方法间检测结果仍存在较大差异。Bachmann等^[18]收集332份未冰冻尿样，分析评估雅培、强生、贝克曼、罗氏、西门子等公司17个不同分析系统u-ALB检测结果的现状。这些分析系统与Mayo Clinic的质谱法结果比较有正偏差也有负偏差，最大的正偏差与最大的负偏差之间差异巨大，在12~30 mg/L、31~200 mg/L和201~1 064 mg/L区间内分别为45%、37%和42%。

Jacobson等^[19]评价了美国和加拿大通过认可的24个实验室u-ALB及ACR的准确性。与质谱法相比，各个实验室u-ALB结果呈负偏差（-7.9%~-26.0%），并且部分分析方法或者实验室的u-ALB检测的分析不精密度仍然是一个主要问题。2012至2017年波兰地区检测u-ALB、u-Crea和ACR的总体变异分别为20%、6.5%和36%^[20]。2019年在国家卫生健康委临床检验中心组织的全国尿液定量生化检测室间质量评价中，参加u-ALB和u-Crea检测的实验室数量分别为548家和599家，其中同时参加两个项目的实验室数量为506家，剔除离群值后分析剩余430家实验室的总体分析变异，u-ALB为11.6%~20.7%，u-Crea为6.6%~8.5%，ACR为15.5%~42.6%。总体情况与波兰EQA相当。

三、u-ALB检测的标准化

（一）参考物质

1．尿液蛋白标准物质：

早期IFCC计划与欧盟标准物质研究所合作参照CRM 470的制备方法制备尿蛋白二级参考物质，包括白蛋白、免疫球蛋白G、α₁微球蛋白、视黄醇结合蛋白、转铁蛋白、κ轻链、λ轻链和α₂巨球蛋白。以α₁微球蛋白、视黄醇结合蛋白、κ轻链和λ轻链的纯物质以及CRM 470作为一级参考物质为该尿蛋白候选参考物质定值^[21]。目前尚无该候选参考物质的后续报道及销售信息。

2．u-ALB一级参考物质和二级参考物质：

截至目前，绝大多数市售u-ALB检测方法能溯源到IFCC血清蛋白参考物质CRM470（后更名为ERM-DA470），2010年ERM-DA470k/IFCC替换了快售罄的CRM470。ERM-DA470k/IFCC的基质是经脱脂处理的人血清，与尿液样本间存在互换性问题。IFCC WG-SAU小组一项重要任务就是制备适用于u-ALB检测的具有互换性的参考物质。NIST为此研制了尿白蛋白的一级参考物质（SRM 2925）和二级参考物质（SRM 3666）。SRM 2925是重组HSA的水溶液，仅适用于ID LC-MS/MS。SRM 3666是含有白蛋白和肌酐的冰冻人尿液，有4个浓度水平，适用于校准包括免疫法在内的临床实验室常规检测程序^[22,23]。这两个参考物质目前仍处于评估状态，尚未对外销售。

Itoh等^[24]将市售高纯度HSA溶于纯水中，经纤维素膜透析和滤膜（0.2 μm）过滤后，HSA溶液再经凝胶过滤分离得到仅含有单体HSA的溶液，成品为是冻干物质（cRM-UA）。该物质以ERM-DA470作为校准品，定值和不确定度（k=2）为（225.1±9.11）mg/L，cRM-UA在溯源链上比ERM-DA470低一级，可作为u-ALB的二级参考物质用于校准和质控。

（二）参考测