流感的病原学诊断有哪些新技术？模块化检测平台具有哪些特点？二代测序和三代测序技术 ...

• 目前的检测方式主要集中在定性检测，缺乏方便准确的定量检测方法。

简单迅速：方法操作简单快速，容易自动化操作，便于大规模检测。

根据流感检测时间窗口，我们可以看到比如PoCT、荧光检测技术、病毒分离培养法、RT-PCR这些方法，它们检测的时间和时间段有所不同。从这张曲线图我们了解到，大多数方法在1-7天内病毒复制，流感病毒在感染后3-5天达到最高的病毒载量。RT-PCR的检测时间窗口最长，可以达到14天。血清学的诊断方法也就是抗体检测，相对来说比较滞后，大概14天后才可以用于检测。

由于流感是呼吸道疾病，流感病毒主要在呼吸道上皮细胞中复制，所以优先选择呼吸道样本进行病毒检测，比如鼻拭子、咽拭子、鼻咽抽提物、鼻洗液、咽漱液，气道抽提物。来自尸检、胸腔手术、肺穿刺活检的样本以及BALF样本如果能检测到病毒通常意味着下呼吸道感染，意义重大。进行病毒分离样本应尽量最大化收集到病毒感染的上皮细胞、鼻咽抽提物和洗液含有较多的上皮细胞，病毒分离效果较好。还有其他的检测，比如血液、关节液，消化道样本通常情况下很少出现病毒，送检意义不大。禽流感重症病例高度怀疑系统性感染时可以考虑送检。

有细胞培养和鸡胚培养（9-11日龄鸡胚）这两种方法。刚才提到，病毒分离培养技术常规实验室无法做到，只有在CDC和一些研究机构才能进行。

包括胶体金快检/免疫荧光检测，血凝抑制实验和中和实验。

最常见的就是PCR检测（荧光定量PCR），还有一代测序、新一代测序技术（Next generation sequencing），都有在文献里有一些报道。

病毒培养一直是流感病毒鉴定的金标准，可以进行后续的抗原耐药监测实验。但是由于耗时费力（3-5天），并且对技术人员的要求相对来说较高，对环境要求也很高，所以在临床诊断中无法大规模使用。

比较常用的是胶体金抗原检测，现在也有些试剂的厂家在做。胶体金抗原检测的原理很简单，胶体金即薄膜免疫层析技术，它利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测鼻咽拭子标本中的甲型和乙型流感病毒的，病毒核蛋白单克隆抗体连同一种对照抗体分别被固定到膜支持物上，形成三条独特的线。膜支持物跟其他试剂/垫结合在一起构成检测条。当样本中有流感病毒时，金标抗体将与病毒结核并被Test line的第二个抗体捕获形成肉眼可见的线，即为阳性。

这个方法速度快，10~15分钟即可得到结果，但准确性较低，不能作为病毒阴性的诊断标准。

这篇文章汇总了六种不同快速检测方法对甲型和乙型流感的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）的比较。其中涉及不同厂家的品牌，这些品牌都会明确指出是针对甲流或乙流。在这些试剂盒里面，第5个试剂仅能检测甲型流感抗原，明确提出无法检测乙型流感抗原。但是目前所用的大部分检测方法都可以用于甲流和乙流。整个数据显示，敏感性相对来说没有特异性显示的数据好，特异性几乎都是100%，而敏感性最低为10%。因为第5个试剂只能检测甲流，无法检测乙流，所以就没办法统计乙流的敏感性。

总体而言，胶体金法时间短，15~30min出结果，阳性结果具有诊断意义。但是敏感度一般在40%-75%之间，在病毒载量较低时无法检测到目标病毒，检测阴性不能作为排除流感感染的诊断标准。胶体金方法的靶标是流感病毒NP和MP蛋白，可以确定病毒是甲型/乙型，但无法确定病毒的亚型。

也有实验室使用血清抗体检测的方法，但是这个方法没有被指南推荐。图中显示的是在病毒感染后各种抗体IgM、IgA、IgG产生的时间，我们可以看到lgM产生时间最早，大约占到血清总抗体10%，同IgA一样可分泌到呼吸道粘膜，抵抗病毒侵入。而lgG抗体产生时间较晚，但持续时间较长，含量占到血清总抗体水平的70%。IgA是粘膜免疫的主要成员，主要分布在上呼吸道，是局部抗体，占10%左右的比例。目前，急性期和恢复期抗体水平4倍升高可作为诊断的金标准。

由于IgM的产生时间早于IgG，因此针对IgM的检测方法理论上可以尽快发现感染。而且IgM的持续时间短，高水平的IgM更有可能是当前感染产生的（而不是先前暴露产生的）。但单次的IgM检测仍然不能作为诊断的依据。

抗体一般在患者恢复期才大量产生，恢复期抗体水平4倍升高才能明确诊断，时效性差。而流感病毒抗原性高度易变，很容易发生抗体/抗原不匹配而产生假阴性。不同流感型别之间还可能存在交叉反应，影响检测的特异性。并且，流感病毒人群感染率高，特别是季节性流感，大部分人群体内已存在较高水平的抗体，增加了结果判定的难度。如果免疫缺陷患者是流感感染的高风险人群，而这类患者的抗体产生不足，无法有效诊断。所以，目前抗体检测的方法还没有作为非常确证的一个依据。