血浆游离DNA检测临床意义的研究进展

游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）是一种血液或体液中游离于细胞之外的DNA。1947年，Mandel和Metais^[1]首次报道了外周血中存在cfDNA。生理情况下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡，在某些疾病和特殊状态下，其他细胞也会释放游离DNA入血，包括来源于肿瘤细胞的循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA），来源于胎儿的cfDNA等。1994年，Vasioukhin等^[2]和Sorenson等^[3]在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和胰腺癌患者外周血ctDNA中发现了RAS基因的突变，表明可以利用ctDNA发现肿瘤的特异性基因突变。随着新的研究结果的不断出现，cfDNA用于疾病早期诊断、预后评估、疗效监测等方面的潜在价值越来越受到关注。检测血浆或血清中cfDNA可视为一种"液体活检"，有利于开展各种相关诊断，并能避免有创的组织活检。以血液为检测标本，使重复采集检测样本成为了可能，从而有利于对疾病的发展及肿瘤的治疗过程进行跟踪监测。

血液中cfDNA的来源与细胞凋亡、坏死和细胞主动分泌DNA有关。正常生理情况下，巨噬细胞会清除凋亡和坏死细胞，因此健康人血中cfDNA浓度很低。然而，在恶性肿瘤、剧烈运动或体内存在炎症等情况下，巨噬细胞不能有效清除凋亡和坏死的细胞，细胞内的DNA被释放至血中。目前cfDNA的检测主要用于肿瘤的检查和产前诊断，但是，最新的多项研究表明，cfDNA水平在心肌梗死、冠心病等心血管疾病中也会出现显著的升高^[4]。

cfDNA多以DNA和蛋白质结合的复合物形式存在，仅极少数为游离的DNA片段。cfDNA在血浆和血清中都有存在，健康人外周血中cfDNA浓度大都小于100 ng/ml，平均值约为30 ng/ml。而在肿瘤患者体内，外周血cfDNA浓度可高达到1 000 ng/ml，平均值约为180 ng/ml。在其他的一些疾病，包括术后、寄生虫病、心血管疾病等也可见cfDNA水平的升高^[4,5,6,7]。

目前，血浆cfDNA的产生机制尚不明确。医学界主要认可两个主要机制，其一是细胞发生凋亡或者坏死后会释放出DNA片段。凋亡坏死的细胞产生这些带有典型的凋亡坏死细胞特征的片段化基因组DNA可通过毛细血管壁或者淋巴管壁渗透到外周血循环中。另外一种观点认为，是有核细胞裂解释放出DNA片段，例如一些侵入外周血循环的细胞（如肿瘤细胞）会在吞噬细胞的作用下裂解释放出DNA片段，从而产生cfDNA^[8]。目前普遍认为细胞发生凋亡或者坏死释放的DNA片段是cfDNA的主要来源，但是不同疾病发生的病理生理进程不同，致病机制和疾病微环境也不同，因此不同疾病导致产生cfDNA的过程极为复杂，单一机制不能充分的阐明cfDNA产生的来源，往往是同时存在这两种产生机制。

目前cfDNA的检测方法包括单链构象多态性分析聚合酶链反应法（polymerasechain reaction，PCR）、限制性片段长度多态性PCR法、测序和数字PCR等。前两种方法由于敏感度较低，目前已经被后两种方法取代。

测序法可以对cfDNA进行深度分析，对未知突变进行筛查，并分析基因遗传多态性。该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序，目前所说的高通量测序技术主要是指第二代测序和单分子测序，以及在这两者基础上发展的技术^[9]。第二代测序技术的原理主要是酶级联化学发光反应，即在生成新DNA互补链的过程中，要么加入的脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）通过酶促级联反应催化底物发光，要么直接加入被标记的dNTP，使其在合成或连接生成互补链时释放信号，通过捕获信号来转化为一个测序峰，从而得到序列的信息。单分子测序技术的原理主要是对待测DNA进行随机打断，之后对小片段末端加上poly-dA，然后使之与芯片上的poly-dT杂交并精确定位，再逐一加入荧光标记的末端终止子，之后进行检测并对荧光基团切除，允许下一个核苷酸渗入，如此通过渗入、检测和切除的循环，即可实时读取大量序列。

数字PCR法灵敏度更高，检测速度更快，但只能对已知的cfDNA突变类型进行分析。其主要的原理是将单个DNA分子于独立反应室中进行PCR扩增，利用不同标记的探针检测特定的靶DNA序列，根据呈现的不同信号类型的反应单元比例和数目进行统计分析，实现检测特定血浆cfDNA的绝对定量^[10]。在整个检测过程中不需要扩增标准曲线和管家基因，准确度和重复性好，能够实现真正意义的绝对定量。根据其分液方式的差别，可以分为3种：微流体数字PCR、微滴数字PCR和芯片数字PCR。其中在血浆cfDNA检测中，微滴数字PCR的方法应用更为广泛和成熟^[11]。

另外，基于实时荧光定量PCR平台检测cfDNA的方法也广泛应用，如扩增受阻突变体系和肽核酸钳制PCR等^[12]。对于cfDNA的检测也具有高灵敏度和特异度，然而由于其价格比较昂贵以及技术的复杂性，制约了这些检测方法的发展。

1．cfDNA在肿瘤诊断中的应用：

肿瘤患者血浆内循环肿瘤细胞释放或原位肿瘤细胞释放入循环的cfDNA也称ctDNA，ctDNA在肿瘤诊断中的研究方向主要包括：ctDNA突变的检测、肿瘤特异性微卫星改变、表观遗传学改变、ctDNA完整性检测以及病毒DNA检测。ctDNA的突变检测既能够得到与肿瘤组织相对应的基因突变结果，也能够更敏感更特异的检测出肺癌的EGFR基因突变、结直肠癌的KRAS突变、黑色素瘤的BRAF突变等典型的特征性突变。研究表明，检测肺癌患者ctDNA中的EGFR基因突变，敏感性可以高达80%以上，有利于监测耐药基因^[11]。而转移性结直肠癌患者血浆ctDNA中KRAS基因突变的检测敏感度高达87.2%，特异度高达99.2%^[13]。另有研究对59例结直肠癌患者的血浆ctDNA突变谱进行筛查，发现至少128种基因点突变，其中筛选出特征性突变24种，最常见的是KRAS（G12C）、KRAS（G12D）、KRAS（G12V）、TP53（R273C）和BRAF（V600E），通过联合多重PCR、深度测序和数字PCR的方法，仅仅需要等位基因突变的频率在0.1%以上即可检出^[14]。另外，检测血浆ctDNA还能获得疾病早期的DNA突变结果，利用二代测序等更灵敏和特异的方法检测ctDNA，能够发现胃癌、乳腺癌和肺癌的肿瘤早期特定基因的突变^[15,16]。

肿瘤ctDNA完整性检测也是当前研究的热点。完整性检测的主要原理是由于肿瘤坏死过程中会释放出较长较完整地DNA片段，而正常凋亡的细胞释放的cfDNA则较短。检测ctDNA的完整性能预测早期癌症的发展和微转移^[17]，目前研究最多的是ALU和LINE1序列，它们在DNA损伤修复、转录过程、表观遗传和转座子等方面起到重要作用^[18]。ctDNA完整性的检测是独立于基因突变的检测因素，与体细胞突变检测联用可以提高检测灵敏度和特异性^[19]。另外，研究ctDNA中基因杂合性缺失^[20]以及ctDNA的甲基化水平^[21]也能为肿瘤的特异性诊断和患病风险预测提供帮助。ctDNA的甲基化检测也有助于肿瘤的早期诊断。

目前肿瘤ctDNA的检测方法逐渐增多，新的方法如碱基位点错配率的高通量测序分析和特殊基因启动子的甲基化分析都能更准确捕获到肿瘤内在异质性的特征。阐明ctDNA的特殊基因或表型改变可以更好地反映肿瘤发展过程的分子异质性特点，也有利于监测实时的基因突变情况，便于判断预后和疗效。

2．cfDNA在无创产前筛查中的应用：

cfDNA检测也广泛应用于无创产前筛查（noninvasiveprenatal testing，NIPT）中。对于NIPT检测cfDNA的方法主要是基于下一代测序技术（next-generationsequencing technology，NGS）的方法发展的，包括随机高通量平行测序、靶点或染色体特异性测序和单核苷酸多态性测序^[22,23,24]。孕妇血浆中的胎儿cfDNA约占母体血浆总cfDNA的10%以上，通过检测这些胎儿cfDNA的情况可以判断胎儿的RhD血型、性别、染色体非整倍体疾病、单基因遗传病等相关信息。另外，这种检测孕妇血浆胎儿cfDNA的方法较羊水穿刺或者绒毛活检等侵入检查方法创伤性小，大大降低了宫内感染、流产等并发症的风险^[25]。目前主要应用于对于常见的非整倍体染色体疾病，包括21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征的筛查判断^[26,27,28]。此外，其在性染色体非整倍体疾病、染色体微缺失、拷贝数异常以及一些单基因遗传病中也有报道^[29]。研究^[30,31]发现，无创产前筛查cfDNA具有极高的敏感度（大于99%）和特异度，而假阳性率比较低（小于0.1%）。目前，国际产前诊断学会（International Society forPrenatal Diagnosis，ISPD）^[32]、美国妇产科医师协会（The American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）^[33]和美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）^[34]推荐具有高危风险因素的孕妇应在怀孕时进行cfDNA检测染色体非整倍体疾病（如21三体综合征）和单基因遗传病。而也有研究认为即使非高危风险因素的孕妇也应该进行cfDNA的无创产前筛查检测^[35,36]。2016年ACMG更新了相关的建议，提出了针对所有的妇女，NIPT都应该是一种胎儿非整倍体筛查的选择^[37]。目前对于21三体、18三体和13三体的检出率已经提升到99%、90%和89%^[27]。通过提取母体血浆的凋亡的胎儿滋养层细胞释放出的cfDNA，来检测胎儿是否存在21三体、18三体和13三体的异常染色体表现，甚至对于性染色体X和Y的异常情况也能进行判断^[38]。最近的研究表明通过血浆cfDNA检测21号染色体三体异常的敏感度和特异度分别是100%和99.5%，检测18号染色体三体异常的敏感度和特异度分别是91%和99.2%，检测13号染色体三体异常的敏感度和特异度分别是100%和99.6%^[39]。据此，进一步表明利用cfDNA检测胎儿染色体是否存在异常的适用性好。

针对cfDNA的NIPT筛查不仅能发现非整倍体和单基因遗传缺陷，还能发现胎儿染色体是否存在微缺失现象^[40]。而针对cfDNA的NIPT检测具有较高的灵敏度和较低的假阳性率，这种方法可以用来对胎儿的先天性疾病进行筛查以决定是否需要进行有创检查来确诊，但是目前的研究认为对阳性结果仍需要使用经典的有创检查进行确诊^[41]，可以考虑的检查方法包括荧光原位杂交（fluorescence insitu hybridization，FISH）、羊膜穿刺活检以及基因芯片技术等。

3．cfDNA在心血管疾病检验中的应用：

cfDNA主要来源于凋亡或坏死的细胞，在这种情况下会因cfDNA的释放入血而出现血浆内水平升高。冠心病往往会出现心肌长时间严重缺血导致的心肌细胞的坏死和凋亡。特别是在心肌梗死（myocardial infarction，MI）发生时，除了伴随心肌缺血造成的心肌细胞坏死和凋亡引起cfDNA的升高，cfDNA的清除延迟和障碍也与疾病的发病有关^[42]。冠心病患者血浆cfDNA升高可以用以补充心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）的诊断结果。研究^[43]显示，MI患者血浆cfDNA浓度较健康对照升高10倍以上，此外，cfDNA的水平也是一个独立的检测指标，其浓度水平和CK-MB、cTnI以及C反应蛋白无相关性。由于心肌损伤出现时，血浆cf-DNA和肌红蛋白、CK-MB、cTnI等释放的动力学不同，这些指标的达峰时间也各不相同^[42]。cfDNA浓度在心肌损伤早期即可升高（远早于肌钙蛋白），而达峰时间要晚于CK-MB，可以用于早期检测判断心肌损伤情况。另外，cfDNA水平还是一个潜在的监测疾病进程和患者预后的指标^[44]。随访结果显示，出现心脏不利结果的MI患者血浆中cfDNA的水平升高达3.5倍以上^[44]。同时，cfDNA的特异性检测也对研究冠心病的致病机制有帮助。研究发现，由于心肌细胞表达Toll样受体9（Toll-LikeReceptor 9，TLR9），富含GC序列的cfDNA能够识别TLR9从而降低心肌细胞收缩频率^[45]。所以，检测富含GC序列片段的cfDNA有助于认识急性心肌梗死的严重程度和可能的致病机制，从而对其心肌收缩功能的降低提供一种解释。

由于心力衰竭也存在心肌细胞的凋亡和坏死，故也会出现血浆cfDNA的升高。cfDNA可以作为一种心肌功能提高的潜在诊断指标。超过50%的左西孟旦治疗后的心衰患者血浆cfDNA水平的大幅度降低。然而，基于样本量和统计学原因，该研究并未发现cfDNA的水平在心衰患者和健康对照组之间存在差异^[46]。另有报道^[47]，在心衰患者血浆中循环核小体水平存在升高的现象，其升高水平与炎症以及心衰其他指标（如N-末端脑钠肽）具有显著相关性，提示基于大样本分析数据表明心衰患者血浆cfDNA显著高于健康对照组。

4．cfDNA在其他疾病中的应用：

除了在肿瘤、无创产筛以及心血管的应用外，尚有报道^[48]认为cfDNA的检测可以应用在自身免疫疾病、感染性疾病、创伤、移植排斥反应、急性胰腺炎、卒中和急性肠系膜缺血等方面。特别是在移植排斥的监测上有很好应用。通过检测尿液中游离DNA特异性可以很好地连续监测肾移植患者发生早期急性移植排斥反应^[49]。

目前cfDNA检验应用于临床常规的瓶颈主要集中于方法学和样本的质量上。cfDNA检测对方法学要求极高，虽然目前cfDNA的检测方法都具有很高的敏感度和特异度，但是仍存在一些和传统病理学或细胞遗传学检测结果不一致的情况。以产前筛查为例，对于无创产前检测阳性的结果仍需经过有创产前诊断的方法进行证实，目前仍以细胞遗传学的检测结果作为金标准^[33,50]。另外，由于不同厂家所提供的提取和检测的方法都不同，导致对于同一段cfDNA检测的定量定性分析都存在差异。由于这种标准化操作的缺乏，使用不同方法检测同一cfDNA的实验室结果也存在一定差异^[51]。目前普遍认为数字PCR方法和高通量测序方法具有极高的检测灵敏度和特异性，但是数字PCR只能检测已知突变，检测的成本和时间也会随检测位点的增加而增多；高通量测序方法对提取得到的DNA浓度和质量要求较高，同时也具有较高的成本和检测周期，都不利于临床常规开展^[52]。另一方面，由于血浆中存在的靶cfDNA微乎其微，标本的采集、抗凝剂使用和保存的不当都会影响检测的质量，造成假阳性或假阴性的结果^[53]。所以，优化提取和检测的方法，进一步提高检测cfDNA方法的灵敏度和特异性，缩短检测的时间，降低检测的成本，同时实现检测方法之间的标准化，都是亟待解决的问题。

综上，cfDNA以其早期出现入血和无创检测的优势，将逐渐成为多种疾病筛查的常规检测指标。未来的研究除着眼于cfDNA与不同疾病的相关性和检测价值外，还应进一步发展更便捷更经济的检测方法，使之能尽快进入日常常规实验室，成为检验科常规检验项目。