参考实验室对厂商检测系统发出溯源性证书的过程和要求

面气灵 2019-10-10 09:33 AM 4279人围观人物

近日，被某公司要求了解脂蛋白检测的有关内容时，我重新上网查阅了美国疾病控制中心的“胆固醇参考方法实验室网络（CRMLN）”的网页，找到了CDC的CRMLN文件，就CRMLN对体外诊断厂商申请CRMLN，对厂商检测总胆固醇、LDL胆固醇、和HDL胆固醇的检测系统是否可溯源至CDC的CRMLN的参考方法，签发溯源性证书的事宜，有正规的文件。我阅读了以后，才真切了解了CDC的CRMLN发出溯源性证书的严密性！应该让我们所有临床实验室的同道都好好地了解。

为此，我将其中对LDLC认证文件内容作了整理。写成这篇微信。供大家参考。

——冯仁丰

美国国家胆固醇参考系统-- 胆固醇参考方法实验室网络，为厂商的LDL胆固醇的认证方案（该文件写于2006年6月）。至今这个文件没有修改。

一、什么是LDL胆固醇的参考方法？

脂蛋白检测的NCEP（原美国国家胆固醇教育计划）工作组，做出了关于临床实验室检测LDLC的建议。工作组建议，以LDLC准确度为基础的，是依据CDC的近期BQ参考方法（β定量方法）为基础。CDCBQ参考方法使用了三个步骤的程序，超离心、以肝素-锰试剂沉淀底部液体、和以Abell-Kendall的胆固醇参考方法定量底部液体和HDLC部分。因为基质效应，在检测处理过的样品时，必须以新鲜样品作为可接受的准确度转换比较的基础。所以，胆固醇参考方法实验室网络（CRMLN）使用了依据新鲜样品与BQ参考方法比较的LDLC方法认证的方案。该方法在CRMLN实验室内使用的方法，是标准化到CDC的LDLC的BQ参考方法。CRMLN相信国家范围的标准化可以通过分析仪器和试剂厂商最有效地实现。

这里，需要介绍什么是CDL胆固醇的β定量方法。

以图1介绍以超离心方法分离血清内残余颗粒（包括乳糜微粒）、与LDL和HDL颗粒。

图1、超离心分离脂蛋白

如图1所示，病人血清样品经超离心后，切除离心管上层的残余颗粒；留下离心管内的底部液体，内含高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）颗粒。以改良的胆固醇Abell-Kendall检测，得到的胆固醇结果为HDL胆固醇（HDL-C）和LDL胆固醇（LDL-C）之和。

对超离心底部液体，使用肝素-锰方法沉淀LDL，离心后的上清液，即为样品中的HDL-C。这样，将未经沉淀LDL的底部液体检测得到的胆固醇值，减去经肝素-锰方法沉淀去除了LDL后上清液内HDL-C的值，即为血清样品内的LDL-C值。

该方法至今被公认为检测LDL-C的参考方法（BQ方法）。

二、BQ参考方法可接受的误差范围

CDC胆固醇测定的参考实验室网络（CRMLN），使用的检测允许误差范围，完全按照NCEP工作组的建议：进行LDLC分析的实验室，对于真值（参考方法）具有的偏移≤4.0%；检测变异系数（CV）的精密度≤4.0%。这些准确度和精密度的目标建议，对于单次检测的允许总误差应≤12%。每个实验室内可以增强良好实验室规范和质量保证可接受原则，去改善精密度。CRMLN实验室内以新鲜样品被LDLC参考方法的检测结果为准，与申请溯源性的厂商产品的检测系统，也对相同该批新鲜病人血清进行LDLC检测，得到的检测结果与参考结果比较具有的误差，在NCEP对误差要求之内的，证实该公司的检测系统具有的准确度，在量值上可溯源至CRMLN实验室的参考检测结果，实现了溯源性。尽管CRMLN相信，评价总误差很重要，它鼓励厂商力争符合NCEP的准确度和精密度。

三、以CLSI的EP9-A导则进行LDLC检测结果比较和偏移估计

对厂商的认证方案是依据临床和实验室标准研究院（CLSI）导则EP9-A，使用病人样品的方法比较和偏移估计。该程序在本文件中也做了概要介绍。该方案包括，使用至少40份新鲜标本与参考方法的比较。该方案也包括了在20批内进行质量控制（QC）物质的分析。展现参考方法的绝对平均偏移≤4.0%，和总CV≤4.0%，作为厂商检测系统取得认证的资格。厂商为该系统的校准品指定的设定点应该是合适的，以确保用户手中的患者标本得到准确分析结果。

因为NCEP建议，临床实验室对病人标本检测结果具有的总误差≤ 12%。但是，在列出厂商LDLC产品的具体误差数据上，必须具有不精密度（批间CV）、不准确度（偏移）、以及由此计算的总误差估计（偏移＋ 2CV）。没想误差指标均需符合要求方可被认可。

四、厂商在申请某个检测系统被认证中的责任

1、厂商需要认识：LDLC认证计划在规定的条件下，被预期用于评估比较方法相对于参考方法的偏移。计划中对样品的要求不是在临床实验室内遇到的。这样，评估方案被设计去验证被评价方法的校准，不是验证检测系统的检测稳健性。

2、厂商的初步的责任

厂商应首先明确申报，需要被认证的仪器品牌和信号、使用的试剂型号和批号、使用的校准品型号和批号。这个组合检测系统符合下列标准指标。

仪器系统必须能够产生分别的数字值。
仪器系统必须在操作高峰条件下，具有实施的所有要求的预防维护程序。
应按照（诸如CLSI EP5-A概要叙述的）进行精密度检测，以确保总精密度≤4.0%。

3、厂商的标本收集

这是关键重要的，在开始这个方案前，厂商与CRMLN实验室联系。与参考方法比较的样品，必须在送达CRMLN实验室时，依然是新鲜的；参考方法不使用冰冻样品。这个要求与CRMLN实验室合作，确保在CRMLN实验室分析的样品，是在收集的当天采集的。厂商还必须分为5个不同批进行分析，和多次的运送。

标本必须是新鲜的；最好是空腹供体采集的。若厂商已经conduct进入了一个仔细的冰冻/冻融研究，确定在检测系统中使用冰冻标本不会影响结果的话，冰冻样品可以用于厂商的检测方法；但参考方法依然要求新鲜样品。认证方案被设计仅评价分析方法的偏移。所以，来自分析前来源的变异，必须被消除或使之为最小。厂商应认真地遵循本节中叙述的样品收集和处理的方案。

4、建议的样品基质是血清；应使用分析系统指定的样品基质进行比较。静脉血清是被用于所有与参考方法比较使用的基质。通过配对样品比较，所有其他血液基质的值必须可溯源回归至静脉血清值。另一些血液基质应包括所有毛细管的样品（包括血清）和所有来自静脉的毛细管处的抗凝血液基质。例如，若厂商系统被指定分析毛细管血浆，厂商希望去认证这个基质，则厂商应收集来自用于比较的病人的成对静脉血清和毛细管血浆样品。厂商应分析毛细管血浆样品，并上交静脉血清样品给CRMLN实验室进行分析。

5、收集样品的浓度分布和要求

1）收集和分析40 个或更多的病人的新鲜标本。这些标本的LDLC浓度，应分布在整个临床上有意义的范围，尽可能遵循下列靶向分布：

■ 20%样品为＜2.59 mmol/L（100 mg/dl）；

■ 30%样品为2.59~3.36 mmol/L（100到130 mg/dl）；

■ 30%样品为3.37~4.14 mmol/L（131到160 mg/dl）；

■ 20%样品为4.15~10.35 mmol/L（161到400 mg/dl）。

样品分送给CRMLN实验室时，同时附上标本分布的表格附录。

2）这些标本必须：

没有已知会影响被检测的检测系统的干扰物质（如，溶血、黄疸、脂血）；
必须收集足够的量（见以下参考方法检测要求的样品体积）；
不包括在产品说明书中指出的样品，应予以剔除；
按照良好实验室规范去收集样品（H3-A4）。

3）必须具有尽可能模仿临床实验室条件的采集和处理标本的方案

为了使比较过程反映真实性，鼓励厂商尽可能模仿临床实验室的条件。形成标本采集、处理和检测的方案；包括关于病人样品储存和分析的时间间隔的信息。储存时间和方法应作为方法形成的一部分予以评价。

这个方案被指定去反映临床实验室的分析情况。需要被厂商分析的样品尽可能类似于被CRMLN实验室分析的样品，血清应在收集的2小时内分离去除红细胞。参考方法分析的血清样品不应冰冻。送至CRMLN实验室的每个样品必须是新鲜的、未被冰冻的分样（11 ml），在收集的1天内送达CRMLN实验室。厂商应将样品储存在冰箱，直至CRMLN实验室收到了分样。CRMLN实验室在收到了样品时将通知厂商；使厂商和CRMLN实验室在样品收集的一天内的相同时间开始分析样品。这个方案要求发送给CRMLN实验室的样品至少分为五个不同批。

4）发送给CRMLN实验室的血清分样要求

参考方法需要的每个血清样品体积至少为11 ml。标本必须明确地用代码号予以标记，不是病人真实信息。标本必须安全地分装在小瓶内，防止破裂、泄漏、和蒸发。

对每个个体收集多个血液管，以得到足够CRMLN实验室需求的量；将各管血清样品倒在一起，充分混匀再行分样。提供给CRMLN实验室的血清，来自相同个人的各个样品管，必须在相同时间收集，如果检测方法使用的是血浆或全血。

如果一个个体的样品量不够，可以将两个标本混合-- 但不能超过不同个体的两份标本。这个混合标本应如非混合的（单个）样品那样处理。混合的标本应充分混匀后再行分样。

一些用于被CRMLN对其他分析物认证的可以使用相同样品。因为所有样品看来不会符合所有分析物的样品分布指导，应收集更多的样品。这将确保导则符合所有分析物。

CRMLN强烈建议，应送给CRMLN实验室要超过40份样品，避免因样品量不足、离群值或实验室时间等的延误。

【述评】检验医学的发展和展望 协和检验科——病人和死神之间隔着的最后一道门

来源: 冯仁丰

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