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文章来源：中华检验医学杂志,2019,42(7): 489-492 作者：李伟 陶然 尚世强
分子诊断技术的发展加速推进了儿童感染性疾病病原体核酸检测向高通量、高灵敏度、自动化发展的进程。在临床常用的荧光定量PCR技术之外，多重PCR技术、数字PCR技术、等温扩增技术、微流控芯片的应用使病原体核酸检测在通量和灵敏度上有了显著提升，这些技术配合一体机的使用实现了儿童感染性疾病病原体核酸检测的自动化和高通量化。高通量测序技术可以最大程度获取标本中几乎所有病原体的核酸信息，已逐渐成为临床感染性疾病诊断的重要辅助手段。
由于儿童免疫系统发育尚未完善，感染性疾病成为儿童最为常见的疾病，2013年全球有3.26亿5岁以下儿童死于感染性疾病，占所有5岁以下儿童死亡数的50%以上[1,2]。病原微生物的早期、快速、准确诊断在感染性疾病的诊断、治疗和预防中起着至关重要的作用。随着近年来分子诊断技术的不断创新，感染性疾病病原体核酸检测技术也取得了快速发展和广泛应用。
儿童感染性疾病具有病原微生物多样性、复杂性、载量低等特点。目前，病原学核酸检测主要依赖于PCR技术，尤以荧光定量PCR技术的应用最为广泛。荧光定量PCR技术因其实时定量、闭管检测、特异性强等优点，被广泛应用于细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体和病原体耐药基因等临床病原学核酸检测领域[3,4,5]。但该技术也存在通量过低、检测灵敏度有限等缺点，不适用于临床多种病原体的同时检测以及特殊低载量病原体样本的检测。同时，国内各级医疗机构感染性PCR实验室自动化程度不高，也限制了该技术进一步的临床应用。自动化、高通量、高灵敏度必然是未来儿童感染性疾病核酸检测的发展方向。 为了克服荧光定量PCR技术通量低、灵敏度有限的缺点，目前新开发的临床常见病原体核酸检测技术主要包括多重PCR技术和数字PCR技术。
主要应用多重引物，针对不同的病原体核酸或耐药基因进行特异性扩增，根据不同病原体扩增产物的长度差异来判断何种病原体感染，也可以同时检测同一样本中的细菌、病毒、支原体等临床常见病原体及其耐药基因。该技术早期主要通过凝胶电泳和毛细管电泳人工来判断结果，如黄烈等[6]建立了多重PCR技术同时检测流感A、流感B、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒等9种儿童常见的呼吸道病毒，最终通过凝胶电泳分析PCR产物大小来判断病毒类型；张海邻等[7]建立了同时检测病毒、衣原体等11种儿童常见呼吸道感染病原微生物的多重PCR体系，检测结果通过毛细管电泳法进行分析。但该技术存在扩增产物易污染的缺点。近几年一些企业已将PCR扩增和毛细管电泳做成一体机用于儿童感染性疾病的病原学检测，封闭检测降低了核酸污染机率，并通过机器判读结果，减少了检验人员的操作误差和工作量[8,9]。一体机使PCR技术摆脱了场地和荧光定量PCR仪的限制，更适合门诊或基层儿童感染性疾病病原学核酸检测的快速普及。包含列阵数字PCR、磁珠乳液扩增方法（beads，emulsion，amplification，and magnetics，BEAMing）数字PCR和微滴数字PCR。其中微滴数字PCR应用最为广泛，该系统要求在传统PCR扩增前把测试样本分割为成千上万的水包油微滴，分割后每个微滴成为1个独立的PCR反应体系，可以实现病原微生物的绝对定量，将PCR灵敏度提升了10~100倍。在儿科感染领域，微滴数字PCR主要应用于细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原微生物的精准定量检测，如结核杆菌、HBV、HIV和疟原虫等，进而指导临床诊断和治疗[10,11,12]。等温扩增技术可以实现恒定温度下扩增目标核酸片段，不仅避免了PCR反应的升、降温过程，缩短了扩增时间，而且摆脱了PCR仪的限制，能更好地适用于基层医院。依据等温扩增酶及引物设计的特性，等温扩增技术主要包括环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、实时荧光核酸恒温扩增（simultaneous amplification and testing，SAT）、交叉引物等温扩增（crossing priming amplification，CPA）。在病原体核酸的6个区域设计4条引物，通过一系列的链置换扩增反应来实现病原体基因片段的扩增，由于在体系中加入了Mn2+钙黄绿素复合物，扩增反应产生的大量焦磷酸根离子可与Mn2+结合释放钙黄绿素，因而有利于反应结果的观测，使扩增和检测只需一步便可完成，大大提高了检测效率[13]。但LAMP技术难以区别非特异性扩增和极易受污染影响而产生假阳性结果。将病原体靶RNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），再利用T7噬菌体酶将cDNA转录为RNA，通过颈环RNA探针识别RNA产物释放荧光，然后产物RNA不断重复上述过程，由于每个循环可放大100~1 000倍荧光信号，其灵敏度至少可以达到101CFU/ml，优于荧光定量PCR技术[14]。同时，SAT技术的靶标为RNA，可提示以DNA为核酸的病原体的现症感染，目前在儿科感染领域已广泛应用于儿童肺炎支原体和结核杆菌的诊断和疗效监测[14,15,16]。
通过设计扩增引物和两条交叉引物，依靠嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus，Bst）DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使DNA的循环扩增得以不断实现。CPA技术近几年主要应用于儿科结核杆菌感染筛查，特别是在基层医疗机构的结核核酸检测和筛查中起到了重要作用[17]。
基因芯片是将特异的寡核苷酸片段以高密度排列在片基上，与目的片段进行识别和杂交，通过特定的检测系统和分析系统进行结果判读。根据检测靶标的不同，基因芯片主要包括DNA芯片和RNA芯片。近年来儿科感染性疾病病原体检测领域发展最快的是微流控芯片技术。核酸检测微流控芯片将不同的实验室系统缩微在玻璃或者塑料基质上，在微米级的尺度上构建出液流通道、核酸提取池、逆转录和PCR扩增池、杂交池等部件，整合了样本处理、反应、检测的全部过程，可以实现高通量检测多种病原体或进行病原微生物的分型，但目前尚存在单次检测样本量过低的缺点。微流控技术在检测诺如病毒、轮状病毒、星状病毒等儿童常见腹泻病毒方面的应用已有文献报道[18]，未来该技术有望为儿科感染性疾病的病原学检测注入新的活力。
高通量测序技术（next generation sequencing，NGS）的发展，为临床感染性疾病诊断带来了突破性变革。针对临床病原微生物的NGS检测主要采用宏基因组高通量技术（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）。mNGS的主要原理是将提取的病原微生物基因组DNA/RNA进行逆转录和扩增，然后随机打断为小片段DNA，再进行文库构建和上机测序等实验流程，最终生成测序数据，由专业人员进行数据分析和结果报告[19]。该技术可同时检测细菌、病毒、支原体、真菌等所有临床已知及未知的病原微生物。mNGS技术能够获取检测样本中所有细菌的几乎全基因组信息，不仅可以定量明确致病细菌，还可以获取致病菌的基因分型、耐药基因、进化水平和感染途径等关键信息，指导临床病原学诊断、疾病防治和疫苗研发。Mongkolrattanothai等[20]利用mNGS技术确诊了1例表现为不明原因背部和头部疼痛的儿童布鲁杆菌感染病例，最初该患儿被误诊为结核杆菌感染，在明确布鲁杆菌感染后给予对症治疗，该患儿得以完全康复。NGS不仅能解决细菌培养阳性率低的问题，同时在不明细菌导致的暴发性感染的快速诊断中也起到关键作用。2011年，德国暴发了一场严重的由11岁女童最先发病的肠出血性感染疫情，传播迅速并致超过3 000人被感染。Rohde等[21]利用NGS技术快速检测到病原菌为致死性大肠埃希菌O104：H4，并通过测序结果溯源了致病菌的感染途径，确定了O104：H4的致病基因和耐药基因，为疫情的有效防控提供了重要的病原学依据。在病毒感染的诊断方面，mNGS技术可以高通量检测所有病毒DNA片段，获取病毒分型、耐药、进化等关键信息，快速为临床诊疗提供依据。Grard等[22]在对两例不明原因的出血热患儿的血清标本进行mNGS检测后确认病原体为新型的弹状病毒（Bas-Congo virus，BASV），并进一步根据测序结果溯源病毒进化，阐明了BASV的感染途径和致病机制。2014年，西非暴发了一次大规模的埃博拉病毒感染疫情，引发了全世界范围的恐慌。通过mNGS技术对埃博拉病毒全基因组的分析，研究人员明确了埃博拉病毒的流行病学、进化特征、感染途径及致病机制，对后期埃博拉病毒的诊治、防控和疫苗研发起到了决定性作用[23]。真菌感染的临床检测主要依靠传统的培养法，但已无法满足临床快速诊断需求。近年来，随着一系列临床致病真菌基因组数据库的建立和公布，NGS在真菌检测中的价值越来越受到临床的认可。Miao等[24]报道mNGS在真菌高通量检测方面的敏感性和特异度都显著优于传统的培养法，且检测结果不易受抗生素使用情况的影响。
分子诊断技术的发展加快了儿童感染性疾病病原学诊断的进程。PCR技术依然是儿童感染性疾病病原体核酸检测的主要检测方法。微流控技术可以实现病原体核酸检测的高通量、自动化，适合临床儿童感染的多种病原筛查，有望显著提高儿童感染性疾病病原学诊断的能力和效率。mNGS技术是目前临床常规病原学检测技术的重要辅助手段，在复杂性感染诊断中的价值尤为重要，但该技术的临床应用还存在生物信息学数据处理复杂，尚无统一的参数设置和质量控制[25]，现有检测成本过高等缺点，还需不断改进和完善才能达到临床病原体检测的标准。可以预见，分子诊断技术推动下的儿童感染性疾病病原体核酸检测技术未来必然朝着高通量、自动化的方向发展，成为感染性疾病诊断的主要方法。 |
