基因筛查在早期识别新生儿WAS基因相关疾病中的临床应用

一、研究对象

新生儿基因组计划以新生儿重症监护病房（neonatel intensive care unit，NICU）住院患儿为研究对象，于2016年1月在复旦大学附属儿科医院开始实施，于2016年6月开始在协作单位实施。本研究经复旦大学附属儿科医院伦理委员会批准，批准号为复儿伦审（2016）018号，并获得家长知情同意。

基因组计划纳入至2017年12月31日NICU中的5 800例高危新生儿，采用高通量测序方法进行遗传病因的分析。纳入标准：（1）NICU住院患儿；（2）多系统器官畸形；（3）常规治疗效果不佳，如感染、血小板减少、抽搐等；（4）存在无法用常见疾病解释的症状。排除标准：（1）单纯因早产入住NICU者；（2）无法取得家长知情同意者。

本研究为回顾性研究，仅总结分析高通量测序检测到WAS基因致病变异或可疑致病变异的11例男性新生儿患儿。致病或疑似致病变异为符合以下条件中的一个：（1）已经被报道为致病变异，并且既往报道该变异导致疾病的表型和患儿的临床表型相符；（2）未报道过的新变异，但变异类型为对功能影响较大的有害变异，包括无义变异、终止密码变异、起始密码子变异、移码变异和剪接供体或受体变异；（3）在家系内验证结果符合遗传模式的，未报道过的新的错义变异，且变异在公共数据库及内部数据库中，无正常男性携带。

二、方法

1．临床资料：

收集患儿的发病年龄、性别、诊断年龄、初发症状、临床表现、治疗及预后情况。参照WAS基因相关疾病临床表型评分标准进行分型^[6]，1分为仅有血小板减少和血小板体积减小，不伴任何其他临床表现；2分为血小板异常，伴轻度或短暂湿疹，伴或不伴轻度感染；3分为血小板异常，伴持续可控的湿疹和（或）反复可控的感染；4分为血小板异常，伴严重、难以控制的湿疹及反复重症感染；5分：除血小板异常、湿疹和（或）反复感染外，发生自身免疫性疾病和（或）恶性肿瘤。评分低于1分纳入IXLT，1~2分归入XLT，3~4分为WAS，发生自身免疫性疾病和（或）肿瘤均评为5分，XLN不评分。

2．高通量测序分析：

采用美国Qiagen公司微量全血试剂盒提取基因组DNA，参照美国Agilent公司人类全外显子组捕获试剂盒说明书构建文库。采用美国Illumina公司HiSeq2000测序平台进行序列检测。经图像识别、去除污染及接头序列后的数据以人类基因组hg19(GRCh37）为参考序列进行比对，生成初步分析数据，采用GATK软件v.3.2.2进行变异分析。对变异基因区域等进行注释、变异致病性及频率比对、错义变异功能评估预测。依据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）标准对变异进行评级分类。

3．WAS蛋白表达检测：

取患儿、患儿母亲外周血各1 ml，分离外周血单个核细胞，采用流式细胞仪（BD FACSCalibur,美国）检测WAS蛋白表达（WAS蛋白抗体购买自美国BD公司），FlowJo软件进行数据分析。

三、统计学处理

计量资料用均数（范围）描述。

1．一般临床资料：

11例携带WAS基因致病变异患儿均为男性，其中8例因血小板减少入组新生儿基因组计划，3例因其他疾病入组新生儿基因组计划。11例患儿均无明确血液系统疾病、遗传疾病家族史。8例患儿起病于生后第1周，但其中3例就诊原因为其他疾病，入院后发现血小板减少，3例患儿起病于5~8周龄。根据临床评分诊断标准，5例诊断为WAS，6例为XLT。与WAS基因相关的首发症状包括消化道出血（4例）、皮肤出血点（4例）、湿疹（1例），其中1例首发症状同时包括颜面出血点和消化道出血。WAS基因相关疾病临床表型评分1分3例，2分3例，3分4例，4分1例，详细临床表型见表1。11例患儿均反复发生不同程度血小板数量及体积减少，平均血小板数目为32.3×10⁹/L，范围为（5~57)×10⁹/L，平均血小板容积为9.7 fl，范围为8~12 fl。WAS患儿血小板的平均水平低于XLT患儿。WAS患儿在接受治疗过程中血小板数目一直处于波动状态，其中3例患儿接受造血干细胞移植治疗，只有1例患儿血小板水平恢复正常；XLT患儿在接受治疗后均有不同程度好转，3例恢复到正常水平。10例完成常规免疫功能评估（淋巴细胞亚群和免疫球蛋白）的患儿，淋巴细胞亚群和免疫球蛋白均无明显异常。11例患儿均未出现肾病表现。

2．WAS基因致病或可疑致病变异：

全外显子测序共发现11个基因致病或可疑致病变异，包括已报道的4种致病变异，其中1个为既往报道的热点致病变异（c.777+1G>A），3个为移码变异c.107_108delTT、c.436delC和c.1509_*3delAGTG；另外7个为新发变异，包括2个移码变异c.138delG和c.388_390del，4个剪接位点变异c.1453+1G>A、c.734+1G>C、c.135G>A和c.1453+3G>C，1个错义变异c.1118C>T（表1）。4例患儿通过家系验证，发现母亲为致病变异携带者。5例WAS患儿的变异类型包括2个移码变异和3个剪接位点变异。

3．WAS蛋白表达水平：

仅有4例临床表现典型的患儿进行了WAS蛋白检测，其中3例患儿不表达，评分均为3分；1例患儿表达减少，评分为4分。

4．临床干预及预后：

（1）3例WAS患儿接受了造血干细胞移植治疗，均携带WAS基因的有害变异，即2个+1位的剪接位点变异，1个移码变异。其中1例于1岁接受移植，移植后出现反复感染，因脓毒性休克及多器官功能障碍综合征死亡；1例患儿于122日龄接受移植，术前发生支原体感染，术后发生肺部感染，4个月后发生巨细胞病毒感染和移植物抗宿主反应，经治疗好转；1例患儿于1岁3月龄接受移植，未发生移植物抗宿主病，血小板恢复正常水平。（2）6例XLT患儿中，3例患儿分别因"呼吸窘迫综合征""胎粪吸入性肺炎""新生儿高胆红素血症"就诊，入院后发现血小板减少，基因检测后诊断，定期接受IVIG支持治疗，继续随访中。其致病变异种类包括3个移码变异，2个剪接位点变异和1个错义变异。